撰文 | 唐小糖責編 | 酶美
精確的細胞與細胞間識別在生物學中至關重要，其識別的精確性主要由多種表面受體介導，綜合調控發揮作用【1】。精確的細胞識別過程也是治療癌症等疾病的重要靶點，但目前的治療方法（如抗體、嵌合抗原受體（CARs）等）主要依賴於透過與單一癌症相關抗原的相互作用來識別惡性細胞，但大多數癌細胞缺乏單一抗原【2】，所以效果有限。CAR T細胞已在臨床試驗中發現可以與正常組織發生交叉反應【3】，原因是很多正常的上皮組織中也存在CAR 抗原靶點。但生物資訊學分析表明，組合抗原可以增加靶細胞識別的特異性【4】。工程化細胞療法是構建組合識別程式的適宜平臺，多分子識別系統可以透過協調的細胞內調控組裝，生成更高階的細胞識別程式。加州大學舊金山分校Wendell Lim團隊此前設計併合成了Notch（synNotch）受體【5】，透過將抗原識別域（如單鏈抗體（scFv）等）與轉錄調控域相連線，使得只有與特定目標抗原結合時，才會誘導指定基因編碼表達。併成功使用synNotch受體驅動CAR表達，透過雙抗原 “AND”門，實現T細胞對錶達雙抗原靶細胞的精確殺傷【6】。
圖1. SynNotch能以菊花鏈的方式連結多個受體系統，形成多樣化細胞間識別迴路
近日，Wendell Lim團隊在Science上線上了題為“Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors”的研究論文，繼續使用多個synNotch受體作為靈活的調節聯結器，透過菊花鏈（daisy-chained）等方式連結在一起，形成一個具有精確的輸入和輸出功能的廣譜受體，實現了更完整的細胞與細胞間的識別行為。
研究人員首先對比了來自53個人類黑色素瘤細胞系RNA測序資料，發現與正常的黑色素細胞相比，黑色素瘤系過度表達表面抗原MET（肝細胞生長因子受體），因此，研究人員利用胞內黑色素細胞抗原MART1和MET，透過構建抗MET synNotch → 抗MART1的TCR迴路用以區分黑色素瘤細胞和正常黑色素細胞。結果顯示CD8+ T細胞特異性對MET+/MART1+ 腫瘤細胞表現出增殖和細胞毒性特徵，表明synNotch → TCR迴路可以穩定發揮作用，並證明了抗pMHC的scFv可以作為synNotch（inNotch）受體的識別頭。
圖2 抗MET synNotch → 抗MART1的TCR迴路用以區分黑色素瘤細胞和正常黑色素細胞
這種組合識別策略也可以新增陰性抗原，即“NOT”門，抗原在正常組織中表達而不在靶癌細胞中表達。研究人員構建了一個啟用促凋亡因子tBID表達的synNotch迴路，稱之為OFF-Notch，受到刺激時迅速誘導T細胞凋亡，從而抑制CAR T細胞對靶細胞的殺傷功能，防止交叉反應。研究人員進一步建立了兩個具有不同轉錄調控域的正交synNotch平臺，包含“AND”門和“NOT”門三抗原，將抗HER2的“NOT”門與抗GFP和CD19的“AND”門相結合，在不同HER2、GFP和CD19表達模式的K562細胞混合池中加入表達該回路的CD8+ T細胞，發現只有那些表達GFP、CD19和NOT HER2抗原組合的靶細胞被殺死。GFP+/CD19+ 腫瘤細胞誘導了T細胞擴增，但這種增殖被同時表達HER2的靶細胞顯著阻斷。
圖3. 透過正負邏輯閘，使用synNotch模組驅動啟用和凋亡輸出
除了“AND”門聯合“NOT”門外，研究人員也證明了多個“AND”門結合（CAR識別第三種抗原），有兩種方式，類似於電路中的串聯（synNotch A誘導synNotch B的表達，而synNotch B又誘導CAR C的表達）和並聯（synNotch A誘導CAR第1部分的表達，而synNotch B誘導CAR第2部分的表達）。在體外試驗中，串聯效果和輸出訊號強→弱級聯傳遞時效果相對更好，並在表達不同受體的K562腫瘤細胞移植的小鼠體內實驗得到驗證。
圖4. 三抗原“AND”門的體內驗證
此外，“OR”門的殺傷功能也可以透過synNotch受體誘導串聯CAR表達來實現，研究人員成功驗證了靶向EGFR和HER2的功能。並將“OR”門聯合“AND”門，納入一個三抗原的迴路（串聯synNotch → MET CAR）中發現，產生的T細胞能夠有效殺傷表達MET與EGFR或HER2結合的靶細胞。
圖5. 利用synNotch整合迴路提供多樣化的細胞間識別策略
總的來說，該研究透過使用synNotch受體轉錄互聯多個分子識別事件，設計了一個多樣化的多受體細胞與細胞間識別迴路庫，工程化的T細胞可以透過AND/OR/NOT門整合細胞外和細胞內的多個抗原識別資訊，以實現對靶細胞更精確更強大的識別功能。值得注意的是，2020年9月23日，Wendell Lim團隊和普林斯頓大學Olga Troyanskaya團隊在Cell System上線上了另一項研究，透過機器學習分析了癌症細胞和正常細胞中的數千種蛋白資料，篩選數百萬種可能的蛋白組合以精確靶向癌細胞【7】。Wendell Lim同時在Science上線上了一篇觀點文章：“Engineering cytokines and cytokine circuits”，透過對細胞因子調節進行程式設計，實現對其在時空上的精密控制，有利於基於細胞因子的癌症和其他疾病的治療作用。如IL-2已被FDA批准用於治療黑色素瘤和其他癌症等等，但IL-2臨床上半衰期較短（血清半衰期為90分鐘），高劑量的IL-2才能達到治療效果，但高劑量IL-2同時會靶向健康器官從而引起全身毒性。此外，IL-2還能靶向多種免疫細胞具有多種功能。
透過工程化改造，如將IL-2附著在聚乙二醇（PEG）等基團上，可以延長血清半衰期，PEG化的IL-2作為原藥透過阻礙受體結合來減輕給藥後的快速全身啟用，PEG釋放後，遊離的IL-2便隨著時間的推移而功能化可利用，但這些方法並不能充分解決全身毒性和多靶向的主要問題。而更加精細的蛋白質工程和細胞工程可以在多層次上對細胞因子驅動的免疫反應的時間和空間進行程式設計，如一種透過設計增加了對IL-2Rβ的結合親和力的名為“Super2”的IL-2拮抗劑，更傾向啟動低表達具有IL-2-IL-2Rβ穩定作用的IL-2Rα的初始T細胞；此外，可以僅啟用IL-2和IL-15受體共享鏈的工程化細胞因為“neo-2/15”和對內源性IL-18拮抗劑不敏感的細胞因子“DR-18”均有一定的抗腫瘤益處。工程化“受體對”如IL-2/IL-2R（分別為ortho2和ortho2R）可以更加特異性的精確控制靶細胞增殖，該概念也在CAR T細胞等領域具有重大潛力。
圖6. 工程化細胞因子通訊
而如synNotch受體一般的模組化感測受體，則可用於精確調控細胞因子，以響應區域性疾病或組織抗原訊號，具有高度區域性化可程式設計的潛力。這種工程化的細胞遞送系統提供了一種絕佳的精確靶向和調控區域性疾病環境的可能，可用以驅動抗腫瘤反應以及重塑免疫抑制反應，尤其是與工程化的自分泌或旁分泌訊號相結合，可以透過正反饋區域性放大活性。這種迴路特異性高、卻具有區域性化和組織特異性等特點，也能有效減少脫靶效應，因此該策略可能對治療其他涉及炎症失衡的疾病，如自身免疫、纖維化、組織或傷口再生等具有廣泛影響，目前仍在驗證之中。
原文連結https://science.sciencemag.org/content/370/6520/1099https://science.sciencemag.org/content/370/6520/1034
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參考文獻
1. E. O. Long, H. S. Kim, D. Liu, M. E.Peterson, S. Rajagopalan, Annu. Rev. Immunol. 31, 227–258 (2013).
2. C. A. Klebanoff, S. A. Rosenberg, N. P.Restifo, Nat. Med. 22, 26–36 (2016).
3. R. A. Morgan et al., Mol. Ther. 18,843–851 (2010).
4. F. Perna et al., Cancer Cell 32,506–519.e5 (2017).
5. L. Morsut et al., Cell 164, 780–791(2016).
6. K. T. Roybal et al., Cell 164, 770–779(2016).
7. D. Ruth et al., Cell Syst 11, 215-228.e5(2020).