責編 | 酶美

在動物體內特定的細胞群體中進行時空特異性的細胞標記和基因操作一直是生物學研究的技術難題。位點特異性重組酶，尤其是基於Cre重組酶而開發的各種誘導型重組酶系統被廣泛用於細胞標記和基因功能研究【1】。其中光誘導的Cre重組酶系統不僅安全、易調節且具有高度的時空解析度【2，3】。然而單個重組酶系統具有一定的侷限性，很難用於解析複雜的細胞網路，尤其是神經系統。Dre重組酶來源於D6噬菌體，能特異性地識別一段長度為32bp的DNA序列（rox位點）並介導該序列間的DNA發生重組【4】。因其重組效率高且不會與Cre重組酶發生交叉反應，二者常聯合使用以實現更加精細的基因操作【5】。與Cre重組酶一樣，研究者也相繼開發出多種誘導型Dre重組酶，但均為化學誘導系統6。其誘導週期長、效率低且缺乏空間特異性。這些缺點都極大地限制了重組酶在特定細胞類群中實現精準的基因重組。

2020年12月14日，華東師範大學李大力與陽懷宇、劉明耀課題組合作，在PNAS雜誌上發表了題為Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control genome engineering in the mouse的研究論文。該研究將蛋白質動態構象理論計算與光遺傳學相結合，開發出了高效、嚴格受藍光調控的光啟用Dre重組酶系統（photoactivatable Dre, PA-Dre）並結合組織特異性Cre構建了由藍光和Cre雙調控的新型光誘導Dre重組酶系統，命名為Cre啟用的光誘導Dre（Cre-Activated Light Inducible Dre, CALID）系統，從而在特定細胞類群中實現了高效的時空特異性基因重組和細胞標記，為體內基因操作增加了更為精準可控的新工具。

為了構建出光響應速度快且組份簡單的新型Dre重組酶系統，該研究採取了光誘導分段蛋白重組策略【7】。由於目前還沒有報道過Dre重組酶的晶體結構，如何找到有效的拆分位點成為一個難點。藉助陽懷宇課題組動態構象研究技術，團隊透過計算，預測了將完整的Dre重組酶拆分成兩個片段的一系列拆分位點。透過組合篩選，確認分別將Dre重組酶的N端（第1-246個氨基酸）和C端（第247-343個氨基酸）與藍光調控的Magnets系統【8】融合表達時能更好地響應藍光，從而高效、嚴謹地誘導基因重組（圖1）。

圖1. PA-Dre系統的工作原理。在沒有藍光的情況下，分段的Dre重組酶因相距較遠，沒有催化活性。接受藍光刺激後，分段的Dre重組酶在光敏蛋白的帶動下快速二聚化形成具有完整功能的Dre重組酶即可催化重組反應。

為了降低本底同時增加光誘導Dre重組酶的誘導效率，研究者針對各元件的相對位置、連線氨基酸序列、核定位訊號序列的種類及位置進行了一系列最佳化，最終得到了誘導倍數高達100倍的PA-Dre系統。在HEK-293T等細胞上測試結果表明該系統具有良好的光照時間和光照強度依賴性及高度的時空特異性（圖2）。

圖2. PA-Dre系統的空間特異性（A）用於證明 PA-Dre 空間特異性的照光裝置示意圖。左側為透檢視，右側為實物圖。在黑色的盒子底部有一排藍色的 LED，頂部有一個9釐米的圓孔，上邊放置了一個沒有蓋子的培養皿，其底部覆蓋了黑色鏤空圖案。（B）PA-Dre 和 rox-stop-rox- zsGreen 共同轉染 HEK-293T細胞，將 10 cm皿放置在底部覆蓋黑色鏤空圖案的裝置上進行光照處理。藍色的光透過小縫隙照射到對應區域的 HEK-293T 細胞，啟用該區域的 PA-Dre 發生重組反應，切掉轉錄終止元件引起 zsGreen 的表達（左圖），最終形成了可愛的表情包圖案（右圖，上排為黑色鏤空圖案，下排為zsGreen表達後形成的圖案）。

接下來，研究者分別利用流體動力學尾靜脈注射質粒及腺相關病毒的方法探究了PA-Dre系統在小鼠體內的作用效果。研究結果表明該系統不僅可以啟用外源基因表達，還可在小鼠的肝臟和腦部高效地調控內源基因表達。透過控制注射質粒的量、病毒滴度及光照引數可以靈活地調節被標記細胞的區域和數目，但由於啟動子的限制，還不能實現特定細胞類群的時空特異性基因重組。

為了實現更高解析度的基因操作並擴大PA-Dre重組酶系統的適用性，該研究基於雙重倒置開放閱讀框策略構建了Cre啟用的光誘導Dre（CALID）系統（圖3），並在小鼠大腦中對其效能進行了測試。分別藉助腺相關病毒表達的CaMKIIα-EGFP-2A-Cre病毒和PV-Cre轉基因小鼠，調控光誘導的Dre重組酶，透過調節光照引數和光纖直徑大小，實現了對CaMKIIα興奮性神經元和Parvalbumin抑制性神經元的密集和稀疏型標記。與傳統的稀疏細胞標記方法【9】相比，CALID介導的細胞標記更加高效靈活，僅改變光照引數即可實現不同區域和強度的酶活調節和細胞標記。

圖3. 利用 CALID 系統時空特異性地標記特異性神經元細胞。(A) P1和P2分別是Cre和CALID的特異性啟動子，P1&P2是既表達Cre又表達CALID的區域，在該區域Cre能夠修復PA-Dre 編碼框的方向使其正常表達，在接受藍光刺激後發揮功能。(B-D) 在R26-RSR-tdTomato小鼠海馬DG區注射CALID和CaMKIIα-EGFP-2A-Cre病毒標記CaMKIIα興奮性神經元。（E-F） 在PV-Cre:R26-RSR-tdTomato小鼠大腦皮層注射CALID和CMV-EGFP病毒標記PV抑制性神經元。

綜上所述，本研究開發了藍光啟用的Dre重組酶系統並在此基礎上構建了Cre啟用的光誘導Dre系統，進一步提高了基因重組工具的精準度。與已有的光誘導重組酶系統相比，CALID系統具有更強的普適性，可作為通用型工具與特異性Cre重組酶聯合使用，從而在特定型別的細胞中實現時空特異性的基因重組。今後計劃構建CALID系統定點整合的轉基因小鼠，這樣能更好地與組織特異性的Cre重組酶的轉基因小鼠資源庫相結合，為精確的標記細胞和調控基因的表達提供體內研究的新工具。據悉，華東師範大學博士研究生李慧瑩、張乾森副研究員和顧怡然副研究員為本文共同第一作者，劉明耀教授、陽懷宇研究員、李大力研究員為本文共同通訊作者，中科院周斌研究員，華東師範大學葉海峰和林龍年研究員對本項研究提供了大力支援。

原文連結：

https://www.pnas.org/content/early/2020/12/10/2003991117

排版人：SY

參考文獻

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1. Meinke, G., Bohm, A., Hauber, J., Pisabarro, M. T. & Buchholz, F. Cre Recombinase and Other Tyrosine Recombinases. Chem. Rev. 116, 12785–12820 (2016).

2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M. & Sato, M. A photoactivatable Cre–loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 12, 1059–1064 (2016).

3. Taslimi, A. et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nat. Chem. Biol. 12, 425–430 (2016).

4. Sauer, B. & McDermott, J. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages. Nucleic Acids Res. 32, 6086–6095 (2004).

5. He, L. et al. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat. Med. 23, 1488–1498 (2017).

6. Anastassiadis, K. et al. Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2, 508–515 (2009).

7. Dagliyan, O. & Hahn, K. M. ScienceDirect Controlling protein conformation with light. Curr. Opin. Struct. Biol. 57, 17–22 (2019).

8. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A. & Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat. Commun. 6, 1–8 (2015).

9. Lin, R. et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat. Methods 15, 1033–1036 (2018).