rAAV 轉基因盒僅允許小基因的表達，

因為包裝大小約為4.5-4.6 kb (不包括兩個 ITRs)。

在 rAAV 載體中植入大基因一直是一個挑戰。

內含子和有時外顯子被截斷以便進行適當的封裝。

因此，rAAV 基因盒中的許多大型 cDNA不包含任何內含子或只包含幾個天然內含子。

內含子具有多種功能，

例如，增加 mRNA 的穩定性，調節 RNA 合成速率，引入選擇性剪接，減少高表達基因的 DNA 損傷。

此外，一個內含子可以決定 mRNA 從細胞核到內質網的輸出機制。

除了人工啟動子和 rAAV 表達系統外，去除 rAAV 基因盒中的內含子可能進一步改變基因的內在調控。例如，CRB1蛋白由1406個氨基酸組成，外顯子編碼序列為4221bp，包括3′終止密碼子，其大小接近 rAAV 的最大封裝容量。然而，我們利用短啟動子(< 300bp)和50bp 的人工合成多聚腺苷酸序列，在視網膜細胞型別中獲得了 CRB1的高效表達。

通常不建議使用蛋白質的縮短版本(外顯子截斷，又稱小型蛋白質) ，

因為許多被縮短的蛋白質失去了它們的功能。

例如，許多杜興氏肌肉營養不良症基因的縮短版本(DMD; 2.3 Mb; 79個外顯子; 3685個氨基酸; 11,055 bp)並不能拯救肌肉細胞中的杜興氏肌肉營養不良症表型。

除了使用縮短的蛋白質，人們還可以使用一種替代蛋白質，

如肌營養不良蛋白。

這種策略只有在相關蛋白在細胞中執行類似的功能時才能執行，CRB1和 CRB2就是這種情況。rAAV-CMV-CRB2對小鼠 m ü ller 膠質細胞 CRB1功能的喪失起到了挽救作用。

替代蛋白的免疫原性可能低於天然蛋白。

替代蛋白在 rAAV 基因治療中具有廣闊的應用前景。