撰文 | Gladiator

成年哺乳動物海馬（Hippocampus）的齒狀回（Dentate gyrus, DG）是一種獨特的結構，也是成年大腦中產生新的腦細胞區域之一，維持主要神經元顆粒細胞的成年神經發生【1，2】。多能神經前體細胞(NPCs)具有複雜的徑向膠質形態(稱為徑向膠質樣[RGL]或1型細胞)排列在DG的亞顆粒區，可零星地從靜息狀態過渡到增殖狀態。成年海馬體神經發生具有對生理刺激做出不同調節反應的特徵。儘管目前已經有研究報道了一些相關的通路，但是目前尚不清楚是否存在NPC亞類，以及它們的功能狀態是否與它們對環境刺激的反應有關【3,4】。

細胞的氧化還原狀態，或細胞的“氧化應激”，通常是透過活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的產生和清除之間的平衡來維持的【5】。細胞氧化還原狀態調節幹細胞維持和啟用之間的平衡。細胞內活性氧(ROS)水平的增加與細胞增殖和譜系特化有關。此外，細胞內ROS的絕對含量及其相對變化可以調節各種氧化還原感受器的丰度，並可以作為整合環境訊號和細胞自主訊號的次要信使【6】。

近日，德國德累斯頓神經退行性疾病中心研究團隊Gerd Kempermann在Cell Stem Cell上發表題為ROS Dynamics Delineate Functional States of Hippocampal Neural Stem Cells and Link to Their Activity-Dependent Exit from Quiescence的文章。該研究表明，成年海馬區靜息期幹細胞具有非常高的活性氧(ROS)水平。體力活動觸發Nox2依賴性增加以及細胞內ROS連續減少，從而招募幹細胞進入細胞週期，增加海馬神經發生。

該研究團隊前期工作表明連續四晚的轉輪接觸會導致DG中增殖細胞的數量增加。研究人員首先透過研究持續時間較短的幾次機體活動來研究這種啟用之前的變化特徵。研究發現，至少需要3個晚上的機體活動才能產生顯著的促增殖反應（以胸腺嘧啶核苷類似物BrdU測量）（圖1）。研究人員進一步應用了雙重胸腺嘧啶核苷類似物(CldU，IDU)標記確定DG細胞增殖的主要驅動因素，實驗結果表明機體體力活動刺激一群靜息但可啟用的神經原細胞進入增殖，而不影響其存活和在神經原階段的分佈（圖1）。

圖1 機體活動體力活動招募不分裂的、可啟用的幹細胞進行增殖

DG和腦室下區(SVZ)的NPCs在幾個方面不同，包括它們對生理刺激啟用的敏感性。基於前期研究SVZ細胞對運動沒有神經源性反應，本研究採用主成分分析(PCA) 、GO分析和遊離細胞染色等實驗手段比較了DG和SVZ的來源的NPCs差異基因表達以及ROS水平，研究結果顯示兩者間存在上千個差異表達的基因，並且富集的GO也顯著不同，同時，SVZ細胞的總ROS水平明顯高於DG細胞。進一步解決活性氧含量與NS形成潛力之間的相關性，研究人員根據ROS梯度（Non，hiROS，midROS和loROS）描述了成年海馬神經發生過程中的細胞型別，研究結果表明與周圍的其他DG細胞相比，DG的NPC保持了較高的細胞ROS含量；根據ROS含量將DG和SVZ的前體細胞分解成不同的功能類別，在體外具有不同的幹化潛能；此外，與SVZ相比，NES-GFP+HiROS群體在DG中大量富集。除了氧化還原調控是區分SVZ和DG小環境中成年NPCs的關鍵因素外，本研究還描述了成年DG中NPCs功能亞群中細胞ROS的差異富集，以及其在調節細胞狀態轉變中的出人意料的特異性（圖3）。

圖3 根據細胞內ROS含量可將Nes-GFP+細胞分為不同的功能亞群

為了進一步闡明這種異質性，本文研究了已知可標記細胞程序，如神經發生、細胞週期等的轉錄本的表達，隨著細胞內ROS含量的降低，對維持細胞功能至關重要的轉錄本的表達會出現下降，而活躍細胞週期和神經源性分化的標記物會增加（圖4）。一些RGL標誌物在不同ROS水平的細胞中表達也存在差異。為證實ROS類確實代表了從靜止到神經元活動的變化軌跡，研究人員不僅利用前期其他研究人員關於NES-CFPnuc細胞的單細胞轉錄資料，沿著假時間軌跡研究了它們的特徵轉錄本的表達。同時分析不同ROS水平下多個轉錄因子的變化（圖4E，F）。hiROS和midROS以及midROS和loROS兩組間對比，細胞內ROS含量顯著下降。然而，這種“活性氧下降”與已知的標誌著進入靜止狀態的關鍵基因(如Hopx)的變化並不一致（圖3M）。為了將細胞ROS含量的變化與細胞狀態的轉變進行比對，研究人員將本次的結果與Berg等人(2019)對成年Hopx+細胞的轉錄組分析進行了比較。此外，還單獨比較了hiROS和midROS的表達譜特徵。研究結果表明細胞ROS水平的變化顯示出其不同的功能狀態。

圖4 ROS水平沿神經組織變化軌跡下降

在骨髓細胞、心肌細胞或誘導的多能幹細胞中，較低的ROS含量通常標誌著細胞處於處於靜息期或自我更新，而更高的氧化狀態標誌著細胞具有更高的增殖率和譜系分化。由於Nestin在DG NPCs中有廣泛的表達，研究人員結合其他報告基因系和標記物來分析成年DG的RGL細胞、IPCs、NBs和小膠質細胞，用以確認與1型或RGL細胞相對應靜息hiROS細胞。透過對putative RGL細胞 (Gfap-GFP+EGF+)與Nes-GFP+比較研究及聚類分析研究表明細胞ROS水平最低的Dcx-GFP+細胞為晚期NBs(3型細胞)或有絲分裂後未成熟神經元。進一步透過EdU標記增值細胞及組織特異性分析證明，從增殖到靜息的轉變伴隨著細胞ROS水平的顯著增加，hiROS的NPC是處於靜息狀態的。

由於已經確定HiRos細胞對應於靜止的NPC，並且ROS水平的下降早於脫離靜息期。為進一步解釋急性機體活動將靜止的細胞重新招募到增殖狀態這兒一現象，研究人員首先讓NES-GFP報告小鼠接受兩種體力活動訓練，分析對應條件下NPC-ROS特徵，實驗結果表明機體體力活動會導致NES-GFP+細胞中的ROS波動。線粒體呼吸是細胞ROS的主要來源，線粒體成熟與神經發生髮育階段的增殖和進展密切相關，但是基於線粒體的研究表明劇烈運動後ROS的激增並非線粒體來源。因此，研究人員對細胞內活性氧的另一個主要來源是NOx酶複合體開展了研究。首先分析了不同ROS類別的NES-GFP+細胞中NOx亞型的轉錄表達，進一步為了研究NOX2介導的ROS波動的下游效應，對已建立的下游靶標PTEN及對WT和Nox2突變體的DG中Ki67+細胞的增殖量化表明，儘管Nox2不是增殖所必需的，但它對於身體活動的促增殖反應是必不可少的。為確定Nox2活性的細胞特異性以及Nox2依賴的ROS動態在細胞週期進入中的作用，研究人員透過體外NPC單層細胞培養實驗的結果進一步證實了體內的發現，儘管NOX2活性不是維持細胞處於恆定的基線增殖狀態所必需的，但細胞自主的依賴於NOX2的ROS動力學促進了成年海馬神經幹細胞脫離靜息狀態（圖6）。

圖6 Nes-GFP+細胞的hi-ROS部分中nox2介導的ROS波動對活動介導的前體啟用至關重要

綜上所述，本研究表明在成年小鼠的海馬體中，靜息期的神經前體細胞(NPCs)維持最高的ROS水平(hiROS)。根據細胞ROS含量對NPC進行分類，可以識別出不同的功能狀態。ROS含量的變化為細胞隨後的狀態轉變做好了準備，較低的ROS含量標誌著增殖活性和分化。機體活動是成年海馬神經發生的生理性啟用因子，透過瞬時的nox2依賴的ROS激增，招募hiROS NPCs增殖。無Nox2時，本底水平神經發生未受影響，但活性誘導的增殖增加消失。這些結果提供了NPC功能狀態的代謝層面的分類，並描述了透過行為線索調節細胞ROS與成年NPC啟用的機制。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.10.019

排版人:SY

參考文獻

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1. Wang C, Yue H, Hu Z, Shen Y, Ma J, Li J, Wang XD, Wang L, Sun B, Shi P, Wang L, Gu Y. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 2020 Feb 7;367(6478):688-694.

2. Akers KG, Martinez-Canabal A, Restivo L, Yiu AP, De Cristofaro A, Hsiang HL, Wheeler AL, Guskjolen A, Niibori Y, Shoji H, Ohira K, Richards BA, Miyakawa T, Josselyn SA, Frankland PW. Hippocampal neurogenesis regulates forgetting during adulthood and infancy. Science. 2014 May 9;344(6184):598-602.

3. Jang MH, Bonaguidi MA, Kitabatake Y, Sun J, Song J, Kang E, Jun H, Zhong C, Su Y, Guo JU, Wang MX, Sailor KA, Kim JY, Gao Y, Christian KM, Ming GL, Song H. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 2013 Feb 7;12(2):215-23.

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5. Armstrong L, Tilgner K, Saretzki G, Atkinson SP, Stojkovic M, Moreno R, Przyborski S, Lako M. Human induced pluripotent stem cell lines show stress defense mechanisms and mitochondrial