撰文 | Qi
責編 | 兮
細胞經常暴露在如氧化應激、溫度變化、病毒感染等壓力條件下，為了抵禦這些不利條件並將應激期間的損傷降至最低，細胞啟用一種進化上保守的途徑，稱為整合應激反應（integrated stress response）。這一途徑會觸發翻譯起始因子eIF2α的磷酸化，導致大多數mRNAs的翻譯受到抑制。這種翻譯重程式設計允許細胞儲存能量並將其資源轉移至細胞內穩態恢復【1】。在此期間，整合應激反應也導致應激顆粒（stress granules, SGs）的產生，即由mRNA和RNA結合蛋白組成的無膜細胞器。截至目前，雖已有許多研究報道SGs的成分，特性及其在疾病中的角色，然而人們對其生物學功能在很大程度上仍是未知的。
近年來，在活細胞中使用單分子成像技術的研究已逐步揭示SGs的mRNA募集動力學，但是仍不清楚將mRNA隔離到SGs是否對基因表達有任何影響【2,3】。由於SGs的形成往往與翻譯沉默相吻合，人們推測SGs直接導致應激下的翻譯抑制，且普遍認為SGs中只包含非翻譯mRNA。然而，卻很少有直接證據支援這一猜想。
近日，來自瑞士弗里德里希·米歇爾生物醫學研究所的Jeffrey A. Chao課題組在Cell雜誌上發表了一篇題為 Single-Molecule Imaging Reveals Translation of mRNAs Localized to Stress Granules 的文章，在這項研究中，作者利用活細胞中mRNA翻譯的單分子成像來重新驗證上述假設，以明確的證據表明定位於SGs的mRNA可以完成翻譯，且整個翻譯週期能完整執行，同時可以觀察到mRNA在胞漿和SGs之間的動態轉換。總體而言，作者提出SGs的mRNA定位與翻譯是相容的，並反對SGs在應激條件下抑制蛋白質合成的直接作用。
儘管大多數轉錄本在應激過程中受到抑制，但也有一些轉錄物，如ATF4是啟動應激反應所必需的，並且在eIF2α磷酸化時優先翻譯。為了描述翻譯狀態與應激時SGs對mRNA募集之間的關係，作者首先構建了ATF4-Sun Tag報告轉錄本，用於活體細胞翻譯的單分子成像（見圖1）。此外，為標記活細胞中的SGs，作者將SNAP-tag標記的G3BP1引入細胞系。透過給予細胞應激條件，翻譯和非翻譯mRNA可以透過Sun Tag訊號的存在與否來區分，如前所述，SGs中存在大量非翻譯mRNA，而令人驚訝的是，可以觀察到翻譯的ATF4-Sun Tag mRNA定位於SGs中，這表明SGs並不會抑制mRNA的翻譯過程。
圖1. ATF4-SunTag報告基因mRNA的示意圖以及用於單分子成像以揭示與SGs相關的mRNA翻譯
考慮到在SGs和胞漿中均觀察到非翻譯和翻譯的mRNAs，接下來，作者開始量化翻譯狀態與SGs定位之間是否存在任何相關性。透過影象分析系統，作者發現SGs中約有30% ATF4-SunTag mRNAs進行翻譯，而胞漿中翻譯mRNAs的比例稍高，約佔mRNAs的44%。因此，相對而言，SGs中的mRNA翻譯也並非罕見事件。重要的是，SGs定位的和胞漿定位的mRNAs在Sun Tag訊號強度上沒有顯著差異，由於SunTag強度與核糖體數量相關，這表明核糖體在翻譯mRNAs中的佔有率在胞漿和SGs中是類似的。
一些研究支援SGs並非勻質的，包含穩定的核心和動態的外殼。那麼mRNAs的翻譯狀態是否與其在SGs中的定位有關呢？為此，作者在固定細胞中進行3D斑點檢測和SG分割實驗，並測量從SGs中每個ATF4-Sun tag mRNA到最近SGs邊界的距離（邊界無法精確定義）。分析表明，SGs中的大部分翻譯（76%）和非翻譯（65%）mRNA位於SGs邊界的0.3 μm範圍內，然而，翻譯的mRNA也可以在SGs內部更深層被檢測到，並且更大的SGs中在距離邊界1 μm的地方也可以觀察到。值得注意的是，與SGs邊界的距離與翻譯mRNA的Sun Tag強度無關。因此，這些資料結合先前研究共同表明，翻譯狀態與SGs內mRNAs的定位並無必然聯絡。
接下來，作者透過成像系統觀察到SGs中的mRNAs可以正常經歷“起始、延伸和終止”的完整翻譯週期，與此同時，作者在一些影像中觀察到少部分ATF4-Sun Tag mRNA在胞漿和SGs之間的動態轉換，例如非翻譯的mRNAs從胞漿到SGs或從SGs到胞漿的轉移，但並沒有改變其翻譯狀態。然而，透過分析發現與到達SGs的mRNA相比，離開SGs的mRNA更可能具有翻譯活性，而非翻譯的mRNA更傾向於定位到SGs，並且一小部分SGs的mRNA在離開SGs之前可以從非翻譯狀態切換到翻譯狀態。
上述觀察表明與SGs相關的翻譯對於ATF4-Sun Tag mRNA而言是相對常見的，這是由於其複雜的5’ UTR和兩個上游開放閱讀框（upstream open reading frames, uORFs）結構，使其在應激階段翻譯上調。那麼，許多僅具有簡單5’ UTR結構的mRNA是否能在應激條件下完成翻譯呢？與上述ATF4-Sun Tag mRNA系統類似，作者在強力黴素誘導啟動子下生成一個攜帶5’ TOP-Sun Tag報告基因並穩定表達scFv-GFP、MCP Halo和G3BP1-SNAP的細胞系。利用單分子成像技術，作者檢測到在正常條件下至少有76%的5’ TOP -Sun Tag mRNA進行主動翻譯，而在亞砷酸鹽應激處理期間，翻譯mRNA的比例顯著降低到2%以下。有趣的是，應激條件下翻譯分析顯示，僅存在6/292個翻譯的胞漿mRNA和2/169個翻譯的SGs mRNA。這些資料表明，5’ TOP mRNA的SGs相關翻譯是罕見的，但並不是由於SGs本身的定位所致。
圖2. 5’ TOP-Sun Tag報告基因mRNA示意圖，用於應激條件下SGs中的單分子成像
總的來說，這項研究透過單分子成像技術打破先前普遍認為的“SGs只包含非翻譯mRNA且直接導致應激條件下的翻譯抑制”的觀點，並提出對細胞器內外的生物過程進行定量檢測，對於瞭解細胞器功能而言是十分必要的。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.010
製版人：十一
參考文獻
1. Pakos-Zebrucka, K., Koryga, I., Mnich, K., Ljujic, M., Samali, A., and Gorman, A.M. (2016). The integrated stress response. EMBO Rep. 17, 1374–1395.
2. Moon, S.L., Morisaki, T., Khong, A., Lyon, K., Parker, R., and Stasevich, T.J. (2019). Multicolour single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nat. Cell Biol. 21, 162–168.
3. Guzikowski, A.R., Chen, Y.S., and Zid, B.M. (2019). Stress-induced mRNP granules: Form and function of processing bodies and stress granules. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 10, e1524.