撰文 | tac.G
責編 | 酶美
X線衍射、核磁共振光譜和冷凍電鏡是經典的實驗性結構生物學研究技術，為無數的生物學問題找到了直接、精確的答案。但這些經典的技術仍然存在方法上的侷限性，如均依賴於蛋白表達和純化，而體外純化的蛋白和複合體並不一定反映其在細胞內的結構。並且，這些經典方法在解析極難純化的蛋白複合體和瞬時組裝的複合體往往存在困難。近日，在CASP14上拔得頭籌的AlphaFold為結構生物學研究注入新的驚喜，但距離AI精確預測結構仍有很遠的路要走。
相對於結構生物學家，遺傳生物學家青睞於研究遺傳互作解析基因間的功能，並利用酵母為生物模型，繪製了大量基因互作圖譜。Charles Boone課題組等在2001和2004年分別發表了Science論文工作【1, 2】，釋出了SGA（Synthetic Genetic Array）技術，利用該方法研究雙突變基因酵母細胞表型，繪製了酵母內的基因互作圖譜，解析了多種蛋白的潛在新功能。
2005年，加州大學舊金山分校的Nevan J. Krogan課題組在Cell上發表了E-MAP方法（Epistatic Miniarray Profiles）【3】，以彌補SGA的不足。SGA用於遺傳互作鑑定的表型研究較為有限，主要根據兩個基因是否具有合成致死效應來判斷互作。E-MAP透過對酵母細胞克隆大小等表型進行定量分析，可以相對預測出基因互作的強度。
在2013年的Cell上，Nevan J. Krogan課題組（Hannes Braberg為第一作者）發表了題為 From Structure to Systems: High-Resolution, Quantitative Genetic Analysis of RNA Polymerase II 的研究，拓展E-MAP為pE-MAP（point mutant epistatic miniarray profile）【4】。透過對RNA聚合酶II 53個點突變進行了6000對定量基因互作分析，解析了RNA聚合酶II亞基之間和其他蛋白複合體間在特定位點間功能上的相關性。這一項工作實現在氨基酸序列上利用基因互作技術分析蛋白結構和功能。
時至今日， Science於12月11日發表了Krogan課題組題為 Genetic interaction mapping informs integrative structure determination of protein complexes 的研究工作。本研究在2013年pE-MAP工作成功的基礎上，利用深度定量點突變的基因互作分析解析蛋白結構。
研究人員在本研究中解析了三個結構。其中最主要為酵母組蛋白H3-H4複合體：為分析H3-H4複合體中各位點在結構上的定位，結合深度丙氨酸掃描和修飾殘基的特定突變【5】，同時設計了N端序列截短的H3-H4序列，在酵母細胞中實現對內源H3和H4的雙基因替換，構建了350株酵母突變細胞株，隨後與酵母細胞的1370個基因的敲除或者敲低細胞株進行單倍體配對：
Histon H3-H4突變酵母株與酵母敲除/敲低細胞文庫配對示意圖
透過對每個酵母單克隆表型進行分析，可以獲得不同突變亞克隆與其他基因在功能上的定量分析資料，再透過基因聚類，繪製成該350種突變與其他基因的互作圖譜：
研究人員在資料分析中，設計了MIC （maximal information coefficient）策略進行表型的定量分析。兩個鄰近的位點比結構上較遠的位點具有更高的MIC值。透過對50萬對基因著作資料進行綜合建模，最後繪製了組蛋白H3-H4的結構。該結構對比已有的經X衍射獲得的結構資料具有較高的精確度。研究人員同時也繪製了Histone H3-H4zai COMPASS-C中與其他蛋白的互作結構圖。
為確定該方法具有普適性，研究人員以該流程，對酵母RNAPII和細菌RNAP進行了多達6萬個基因互作分析，並完成結構解析，並發現該技術可與已有的化學交聯和共進化的分析資料相媲美。
在同期的Science雜誌上還發表了題為 Using genetics to reveal protein structure 的評論。評論對比了傳統的結構生物學方法和以pE-MAP為基礎的結構分析，認為pE-MAP可以更真實的反映蛋白複合體在細胞內的原始狀態，且該方法不再依賴蛋白純化的經典的生物化學技術，透過遺傳學手段根據功能性實驗即可進行結構的定量分析。對於結構存在高度可變和瞬時性的複合結構的解析，pE-MAP具有十足的優勢。儘管pE-MAP背後需要巨大的工作量和龐大的資料運算，但隨著基因編輯技術和AI深度學習的進步，我們會逐步實現對蛋白複合體“Native”結構的解析。
pE-MAP進行結構分析流程圖
原文連結：
1. https://science.sciencemag.org/content/370/6522/eaaz4910
2. https://science.sciencemag.org/content/370/6522/1269
製版人：十一
參考文獻
[1]TONG A H Y, LESAGE G, BADER G D, 等. Global Mapping of the Yeast Genetic Interaction Network[J]. Science (New York, N.Y.), 2004, 303(5659): 808–813. DOI:10.1126/science.1091317.
[2]TONG A H, EVANGELISTA M, PARSONS A B, 等. Systematic Genetic Analysis with Ordered Arrays of Yeast Deletion Mutants[J]. Science (New York, N.Y.), 2001, 294(5550): 2364–2368. DOI:10.1126/science.1065810.
[3]SCHULDINER M, COLLINS S R, THOMPSON N J, 等. Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile[J]. Cell, 2005, 123(3): 507–519. DOI:10.1016/j.cell.2005.08.031.
[4]BRABERG H, JIN H, MOEHLE E A, 等. From Structure to Systems: High-Resolution, Quantitative Genetic Analysis of RNA Polymerase II[J]. Cell, 2013, 154(4): 775–788. DOI:10.1016/j.cell.2013.07.033.
[5]DAI J, HYLAND E M, YUAN D S, 等. Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile Library of Synthetic Histone H3 and H4 Mutants[J]. Cell, 2008, 134(6): 1066–1078. DOI:10.1016/j.cell.2008.07.019.