撰文 | Qi

責編 | 兮

基於定量質譜的蛋白質組學方法已經能夠確定細胞擾動和疾病發展過程中參與調節的途徑，並能夠揭示藥物作用和耐藥性機制【1】。然而，許多導致蛋白質功能改變的分子事件並不涉及蛋白質丰度的變化，譬如翻譯後修飾（PTM）、裂解或環境變化引起的構象變化等【2,3】。蛋白質組學工作流程的“變體”，如磷酸蛋白質組學、互作組學（interactomics）和基於活性的蛋白質組學等可以捕獲影響蛋白質功能的特定分子事件，但通常僅能報告單一型別的機制，在蛋白質組大範圍內對不同的調控事件進行高通量同時分析是不可行的【4-6】。

至少到目前為止，人們堅信“蛋白質的結構與其功能密切相關”，那麼是否可以推斷“對蛋白質結構的整體分析將能夠作為一個定量讀數以捕獲大多數蛋白質功能狀態改變的事件”？蛋白質結構整合了導致功能改變的不同型別的分子線索，包括與其他分子的結合、蛋白質間相互作用、PTMs、突變、聚集以及由於細胞基質變化而引起的構象改變等，所有這些都會導致蛋白質的區域性或整體結構改變。因此，透過在蛋白質組大範圍內測量蛋白質結構狀態的改變，可以同時檢測各種型別的蛋白質功能變化，得到比僅測量丰度變化更為詳盡的資料。

2020年12月22日，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Paola Picotti課題組在Cell雜誌上發表了一篇題為 Dynamic 3D proteomes reveal protein functional alterations at high resolution in situ 的文章，該課題組利用先前自行開發的能夠監測蛋白質結構變化、並識別不同條件下結構特異性蛋白水解指紋圖譜的限制性蛋白水解-質譜（limited proteolysis-mass spectrometry, LiP-MS）技術，在經歷營養適應的細菌和對急性應激刺激作出反應的酵母中透過結構讀數捕捉到酶活性變化、酶底物位置佔有率、變構調節、磷酸化和蛋白質與蛋白質的相互作用，精確定位單個功能位點。此外，這項工作驗證了大腸桿菌糖磷酸轉移酶與代謝物果糖-1,6-二磷酸（FBP）之間的相互作用，提出先前未表徵的葡萄糖攝取調節系統。總的來說，這種結構方法在原位報告了許多功能事件，並透過強大讀數來檢測潛在的生理和病理表型背後的分子事件。

首先，作者對指數生長的酵母培養物施加短期的滲透或熱應激，提取蛋白質組後應用LiP-MS工作流程，同時監測蛋白質丰度和結構變化。透過獨立資料採集、無標記定量分析得到的肽混合物，對蛋白質丰度變化資料進行校正，以獲得每種可檢測蛋白質的結構特異性蛋白水解指紋圖譜。為了驗證結構讀數是否能夠準確捕獲已知生物過程的啟用，作者對結構改變的蛋白質進行了功能富集分析，與先前研究一致，例如發現了與翻譯調控和蛋白質摺疊、錯誤摺疊和復性相關功能途徑富集於熱應激資料集。

圖1. 本研究使用的實驗系統以及酵母和大腸桿菌中細胞反應過程中的總體蛋白質結構和豐度變化

由於在滲透應激反應期間MAPK通路中發生若干磷酸化事件，作者將LiP-MS讀數與平行的磷酸化蛋白質組學分析進行比較，證實結構和磷酸蛋白質組學分析關係互補，且根據磷酸蛋白質組學資料和已知的激酶/底物關係，作者確定了12種激酶或磷酸酶在滲透應激條件下的活性發生明顯變化。此外，作者還檢測到其中11種酶的14種已知靶蛋白的結構變化和磷酸化改變，因此，這些結構變化可以透過特定激酶和磷酸酶的上游活性改變來解釋。值得注意的是，磷酸化蛋白質組學分析僅限於蛋白質分子的磷酸化部分，而LiP-MS則監測磷酸化和非磷酸化蛋白池的平均結構狀態，如果磷酸化水平較低，則LiP-MS可能檢測不到差異磷酸化蛋白區域的結構變化。

類似地，基於先前一項報道177種酵母提取物蛋白質在熱激時形成某種“聚集物”的研究，作者探討了LiP-MS報告蛋白質間相互作用的能力。在這項工作中，作者發現酵母熱激後結構改變的蛋白質明顯富集於聚集物，其中177個有96個顯示出結構變化，而只有4個顯示出蛋白丰度變化。隨後，使用超速離心實驗以及新增蛋白酶來確定LiP-MS是否能在熱激時檢測到聚集，或者聚集之前的結構變化。最終結果顯示，結構讀數能夠捕捉到熱激酵母中的蛋白質聚集等的變構調節現象。

接下來對於第二個系統，作者研究了在八種碳源中生長的大腸桿菌，同時利用最近的一項分析，即透過大腸桿菌中心碳代謝（central carbon metabolism, CCM）的代謝物水平和代謝流量在相同生長條件下表現出條件依賴性，作者推斷流量變化可以作為酶功能狀態改變的“代理”，並用它來評估結構讀數的能力，以報告CCM的功能變化。與葡萄糖相比，每種生長條件下蛋白質結構和豐度的差異分析表明，平均共有365種蛋白質發生結構改變，並且有190種蛋白質發生了丰度變化，正如在酵母實驗中所觀察到的，與丰度變化相比，更多的蛋白質發生了結構變化。

類似地，作者也對不同碳源中結構和豐度變化的蛋白質進行功能富集分析。結果顯示，在改變丰度的蛋白質中不存在糖酵解途徑的富集，這與先前的觀察一致，即糖酵解不主要在轉錄水平受到調控，與此相反，在所有生長條件下發生結構改變的蛋白質中均存在糖酵解途徑的富集。諸如此類的結果提示，不同的調控機制控制著生長在不同碳源上的大腸桿菌CCM的不同分支，糖酵解受影響蛋白質結構而非基因表達的調控機制控制，而TCA和乙醛酸迴圈除了影響蛋白質結構的調控過程外，還受到蛋白丰度的影響。

此外，作者推斷檢測到的CCM酶的結構變化可能是變構調節的基礎，那麼在這些情況下，代謝物調節子的水平應該與靶酶變構位點的結構改變相關。為此，作者使用線性迴歸測試八種生長條件下CCM酶的結構變化與相關代謝物水平之間的相關性。基於這部分資料，作者進一步假設代謝物FBP與大腸桿菌ptsI酶的活性位點結合。首先，計算分析表明FBP可能是ptsI的競爭性抑制劑，而體外實驗證實FBP降低ptsI活性。先前研究表明ptsI控制己糖攝取並調節糖酵解流量，有趣的是，FBP被證明是一種細胞內糖酵解流量感測器，因此，作者假設FBP-ptsI相互作用是一個負反饋迴路，在糖酵解中間產物已經很豐富的情況下，可以防止過量的葡萄糖攝取，隨後作者也透過實驗驗證這一觀點。

生物過程是由分子間的相互作用和化學修飾來調節的，然而它們往往不影響蛋白質表達水平，因此在傳統的蛋白質組學篩選中常被忽略。這項研究中利用LiP-MS的蛋白質結構讀數可以原位檢測到蛋白質功能變化，值得注意的是，這種方法並非唯一，其他技術例如交聯質譜法也可用於此目的。總的來說，作者提出將不同條件下獲得的蛋白質組動態原位結構資料結合起來，將能夠擴大結構系統生物學的潛力。此外，對分子事件的定量檢測，例如活性位點佔用率，也能夠支援生物系統建模框架的發展。透過將動態和高解析度的結構資料與功能聯絡起來，使得距離細胞功能的三維模型構建更近一步。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.021

製版人：十一

參考文獻

1. Boisvert, F.M., Lam, Y.W., Lamont, D., and Lamond, A.I. (2010). A quantitative proteomics analysis of subcellular proteome localization and changes induced by DNA damage. Mol. Cell. Proteomics 9, 457–470.

2. Ardito, F., Giuliani, M., Perrone, D., Troiano, G., and Lo Muzio, L. (2017). The crucial role of protein phosphorylation in cell signaling and its use as targeted therapy (Review). Int. J. Mol. Med. 40, 271–280.

3. Russell, C.J. (2014). Acid-induced membrane fusion by the hemagglutinin protein and its role in