綜述|Marcus Conrad：The Metabolic Underpinnings of Ferroptosis

01

鐵死亡（ferroptosis）是一種新型程式性細胞死亡形式，為鐵依賴性脂質過氧化物的積累所導致，最早由哥倫比亞大學的Brent R. Stockwell教授於2012年提出。越來越多的證據表明，鐵死亡是由於多不飽和脂肪酸（PUFA）摻入細胞膜而引起的，其易感性與許多生物過程緊密相關，包括氨基酸、鐵和多不飽和脂肪酸的代謝途徑，以及GSH、磷脂、NADPH和CoQ10的合成途徑等，因此鐵死亡屬代謝性細胞死亡。目前已知鐵死亡與多種退行性疾病（如阿爾茨海默氏病，亨廷頓病和帕金森病）、癌症、中風、腦出血、外傷性腦損傷、區域性缺血再灌注損傷和腎臟變性等病理性細胞死亡有關，但同時鐵死亡也具有潛在的腫瘤抑制作用。人們逐漸發現這種細胞死亡形式可能與許多疾病的發生發展密切相關，並意識到鐵死亡可被用作開發多種藥理學治療手段的基礎。本期導讀論文綜述了鐵死亡的代謝基礎，並概述了其與生物學和醫學其他領域的關係。

“由病理性的代謝和生化過程引起的急性或慢性細胞應激可能觸發鐵死亡。細胞對脂質過氧化導致的鐵死亡的敏感性與幾種代謝途徑有關，例如硒代硫醇、脂肪酸、鐵處理、甲羥戊酸和線粒體呼吸作用。而細胞氧化還原系統的硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和NADPH/FSP-1/泛醌訊號途經則負責監測和處理細胞膜的氧化損傷。”

關鍵詞：

氧化還原代謝、GPX4

FSP1、脂質過氧化

Jiashuo Zheng

德國慕尼黑環境衛生研究中心，

代謝和細胞死亡研究所

Marcus Conrad

德國慕尼黑環境衛生研究中心

代謝和細胞死亡研究所，Director

Marcus Conrad博士是德國慕尼黑亥姆霍茲研究中心（Helmholtz Zentrum München）資深研究員（research group leader），長期以來從事硒蛋白GPX4以及鐵死亡相關研究，曾揭示Gpx4敲除小鼠因爆發鐵死亡而誘發致死性腎衰竭（NCB，2014），論證硒元素對於GPX4抗鐵死亡功能不可或缺的重要作用（Cell, 2018），並首次鑑定出不依賴於GPX4的鐵死亡抑制基因FSP1（Nature，2019）。

02

在鐵死亡這一概念出現的很久之前，Marcus Conrad博士就提出關鍵的鐵死亡調節蛋白GPX4的缺失會導致一種未知的細胞死亡方式，現在稱為鐵死亡（ferroptosis）。之後他的研究團隊還開發了第一種在體內有效的鐵死亡抑制劑，liproxstatins。該團隊最近闡明瞭GPX4中硒代半胱氨酸活性位點對抵抗鐵死亡的關鍵作用。此外，他們還使用全基因組篩選方法確定了新的鐵死亡調節因子（醯基輔酶A合成酶長鏈家族成員ACSL4和鐵死亡抑制蛋白FSP1）。

Jiashuo Zheng, Marcus Conrad,

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.10.011.

鐵死亡——被代謝規劃的死亡命運

1、硫醇系統：氧化還原的扳道工

含巰基的GSH是哺乳動物細胞中的主要抗氧化劑，也是GPX4的首選底物，因此GSH供應不足將直接影響GPX4發揮功能，從而使細胞發生鐵死亡。半胱氨酸（cysteine）是合成GSH的限速原料，主要由胱氨酸（cystine）還原而來，而胱氨酸進入細胞則依賴胱氨酸/穀氨酸逆轉運蛋白SLC7A11（也寫作system xc-）。因此，SLC7A11被視作鐵死亡的最關鍵的上游調節因子之一。近年來研究發現，包括p53在內的一些腫瘤抑制基因以及干擾素γ被發現能夠抑制SLC7A11相關的表達和轉運活性。另一方面，腫瘤細胞也可利用與壓力相關的轉錄因子（如ETS-1、ATF4、NRF2等）上調SLC7A11的表達來抵抗鐵死亡。食物中的蛋氨酸也可以透過轉硫途徑在一定程度上為細胞供應半胱氨酸。在一些腫瘤細胞中，轉硫途徑甚至可以不斷被啟用。經erastin（SLC7A11抑制劑）給藥數天的卵巢癌細胞可逐漸增強轉硫作用以彌補胱氨酸的缺乏。最新的研究證實，破壞轉硫途徑相關酶均可延緩腫瘤生長。

除GSH外，硫氧化還原蛋白TXN是硫醇依賴性抗氧化系統的第二大門派。由SLC7A11過表達所維持的半胱氨酸/胱氨酸迴圈可在GSH耗盡後維持細胞存活，被最終證明有TXN還原酶的幕後支援。SLC7A11和TXN酶系統可協同為角質形成細胞補充GSH。早在1994年就已經有人提出胱氨酸透過TXN還原酶還原為半胱氨酸就能維持GPX4的活性。惡性腫瘤細胞系的TXN酶系統通常十分活躍，同時資料顯示抑制GSH和TXN通路可有效觸發腫瘤細胞死亡。值得一提的是，根據最新的研究推測，硫醇系統的抗鐵死亡作用應該遠遠不止GSH和TXN這兩大派系。

2、細胞內鐵代謝：玩火者必自焚

顧名思義，鐵死亡中的脂質過氧化和細胞膜破裂需要鐵的參與。確實，鐵螯合劑可以抑制鐵死亡，而用奈米顆粒載入的鐵則可誘導腫瘤細胞發生鐵死亡。在生理條件下，位於細胞膜上的轉鐵蛋白受體TFR1以內吞的方式攝入運載鐵的轉運蛋白transferrin，因此TFR1被認為是鐵死亡發生的標誌蛋白。細胞的鐵儲存在鐵蛋白ferrintin中，其蛋白量特別是重鏈的表達減少會增加鐵池和以及細胞對鐵死亡的敏感程度。相反，透過抑制ferrintin的自噬性降解則能使細胞抵抗鐵死亡。

目前認為細胞中鐵的輸出由質膜上與多銅鐵氧化酶（如銅藍蛋白）偶聯的鐵輸出蛋白FPN1主宰。另外，含ferrintin的多泡小體和外泌體也可以在一定程度上向細胞外排鐵。其他與鐵相關的蛋白包括多聚胞嘧啶結合蛋白PCBP1和血紅素氧合酶HO-1也參與了鐵死亡的調節。PCBP1負責鐵的運送，有研究報道小鼠肝細胞特異性缺失PCBP1導致鐵池增加，並加劇肝臟中的鐵死亡。但目前為止學者們並未對HO-1在鐵死亡中的作用達成共識。

近年來，GSH在調節細胞內鐵穩態中的作用引起了廣泛的關注。結合於GSH的亞鐵離子被認為是鐵池中鐵的主要形式。鐵與PCBP1的結合也依賴於GSH。

3、甲羥戊酸途徑：支援多種代謝物協同運作的傑出業務員

甲羥戊酸途徑生成的異戊烯焦磷酸（IPP）、角鯊烯、CoQ10和膽固醇能夠從各個方面影響鐵死亡。其中IPP是角鯊烯和CoQ10的前體。阻斷該途徑限速酶的他汀類藥物會干擾GPX4的有效翻譯，從而增加細胞對鐵死亡的敏感性。有研究提出角鯊烯也能被癌細胞當成抵抗鐵死亡的有力工具。但角鯊烯合成酶SQS的激動劑FIN56卻能夠誘導鐵死亡，這可能是CoQ10消耗所致，後者最近被證實在鐵死亡程序中參與保護機制。有意思的是，基因篩選資料顯示，之前為人們所知的線粒體相關凋亡誘導因子AIFM2，透過利用CoQ10阻止脂質自氧化而躋身為繼GPX4之後的第二大鐵死亡抑制因子陣營，並由此被重新命名為鐵死亡抑制蛋白FSP1。

我們有理由認為膽固醇也參與了鐵死亡：它不但普遍存在於真核細胞膜中，而且對羥基自由基等氧化物天然敏感。GPX4是唯一已知的能夠直接清除膽固醇過氧化物的酶，GPX4活性降低會加劇外源性膽固醇誘導的細胞死亡，而GPX4的過表達能極大地提高細胞對過氧化膽固醇的抵抗力。但實際上並沒有確鑿證據能夠證實膽固醇的氧化真的助力鐵死亡。相比之下，膽固醇的前體，7-脫氫膽固醇的氧化還原活性甚至更勝一籌，它的經典自由基氧化反應速度比膽固醇和花生四烯酸（AA）分別高出200倍和20倍。但無論膽固醇抑或是7-脫氫膽固醇，它們對脂質過氧化和鐵死亡的潛在調節作用仍值得我們進一步探索。

4、線粒體的角色：神龍見首不見尾

至今為止，學術界各門各派對於線粒體在鐵死亡中的作用仍各執己見，甚至對於線粒體究竟是否直接參與鐵死亡都未能達成一致，其複雜程度可見一斑。證實線粒體對鐵死亡有關鍵作用的資料，卻無法解釋線粒體DNA缺失的細胞為何對鐵死亡誘導劑仍然敏感。無奈之下，有研究提出線上粒體對erastin或胱氨酸剝奪引起的鐵死亡是不可或缺的，而且這種必要性並不適用於RSL3引起的鐵死亡。但線粒體缺失的細胞在較高濃度的erastin作用下仍會死亡，令人摸不著頭腦。因此學者們認為，線粒體可能透過其他未知因素或者代謝途徑參與鐵死亡。

站在erastin角度的一系列研究指出，線粒體呼吸鏈複合酶受損所產生的ROS可能是促進鐵死亡的原因。但這首先得解釋線粒體呼吸作用失控的原因：

一方面，SLC7A11抑制或胱氨酸剝奪可導致GSH銳減，從而削弱其對ROS的清除能力。

另一方面，SLC7A11的失活可導致細胞內穀氨酸的蓄積，並轉化生成α-酮戊二酸，後者透過促進TCA迴圈，導致線粒體膜電位超極化。

後續的結果同樣支援這一假說，即線粒體呼吸作用紊亂是抗氧化系統和由谷氨醯胺分解助燃的TCA迴圈系統這兩大勢力此消彼長的結果。而RSL3並不促進谷氨醯胺分解，由此解釋為什麼線粒體對於RSL3誘導的鐵死亡無動於衷。

對谷氨醯胺分解或TCA迴圈的調節可能會影響細胞對鐵死亡的敏感性。例如抗腫瘤藥物大黃素甲醚8-氧-β-葡萄糖苷可升高穀氨酸酶GLS2的水平而發揮促進鐵死亡。值得注意的是，p53可正向調控GLS2的表達，因此，p53的促鐵死亡作用除了歸因於已報道的SLC7A11抑制機制以外，還可能與GLS2有關。

5、NADPH：各大陣營的主心骨

NADPH對鐵死亡的重要性不單單只是供應GSH和TXN系統這麼簡單，它對甲羥戊酸生物合成和脂肪酸的從頭合成和延伸都是舉足輕重、動關大局的存在。NADPH的基礎水平可用作生物標誌物衡量各種癌細胞系對鐵死亡的敏感性，NADPH的匱乏將促進細胞發生鐵死亡。但NADPH也可被NADPH氧化酶利用產生超氧陰離子，對這一過程的啟用或抑制也可能決定細胞是否走上鐵死亡的不歸路。

許多途徑都可生成NADPH，例如磷酸戊糖途徑（PPP）、NADH磷酸化途經以及從異檸檬酸轉化的α-酮戊二酸途徑等。以上途經只有PPP正向調控鐵死亡，其餘二者則持反對立場。這種看似矛盾的局面可能歸咎於各自途經中的酶的亞細胞分佈不同，以及各途經所生成的產物各有不同。因此，儘管大家更傾向於認為NADPH的抗鐵死亡作用必然勝過其促鐵死亡作用，但NADPH實際的角色可能跟HO-1一樣是個兩面派。

6、多不飽和脂肪酸（PUFA）：死神也油膩

最初研究認為含花生四烯酸（AA）或腎上腺酸的磷脂醯乙醇胺（PE）是鐵死亡中的磷脂/脂質過氧化的主要底物，而後續的資料則指向範圍更廣的多種PUFA。哺乳動物細胞中的PUFA主要為食源性必需脂肪酸（亞油酸和α-亞麻酸）經去飽和酶和延伸酶的協同作用轉化而來。去飽和酶2敲低的肝癌細胞能夠抵抗RSL3誘導的脂質過氧化，與PUFA延伸有關的丙二醯輔酶A的合成途徑對鐵死亡起關鍵性的正向調控，此外，丙二醯輔酶A對脂肪酸β氧化的抑制作用也將促進鐵死亡的發生。簡而言之，操縱PUFA的合成或降解過程將最終影響細胞對鐵死亡的敏感性。

在鐵死亡的幕前，脂質過氧化作用影響的主要是酯化的PUFA，而非遊離的PUFA。因此，長鏈PUFA的水解酶ACSL4以及負責將AA重新醯化成溶血磷脂的LPCAT3的缺席將顯著增加細胞對鐵死亡的抗性。就連合成PUFA-醚磷脂的過氧化物酶體也能染指鐵死亡易感。與PUFA酯化相關的報道還包括低氧誘導的脂滴相關蛋白HILPDA、磷脂酶PLA2和溶血磷脂醯絲氨酸脂酶ABHD12等，均展示出對鐵死亡正向和負向調控的一席之地。除了靠PLA2和ABHD12水解磷脂上的PUFA，細胞還具備另一套避免脂質過氧化的備案：利用外源性單不飽和脂肪酸（MUFA）取代磷脂PUFA。多項研究顯示，擔此重任的ACSL3的確十分敬業：突變的KRAS肺癌細胞和淋巴中的黑色素瘤細胞的存活和增殖均依賴於ACSL3。此外，MUFA生物合成必需的硬脂醯輔酶A去飽和酶（SCD）的角色幾乎能夠復刻MUFA的效果。總之，上述研究一致認為，磷脂中的PUFA充足是鐵死亡插手細胞命運的先決條件。

7、脂質過氧化：鐵死亡的門頭牌坊

時至今日，人們仍在為究竟磷脂PUFA氧化物（PLOOH）是如何引發鐵死亡而爭論不休。再說細緻點兒，脂質過氧化究竟是酶催化的還是非酶促的自氧化？究竟誰才是驅動鐵死亡發生的始作俑者？

近些年來，酶促派的研究反覆強調脂氧合酶LOX家族（尤其是ALOX15）在脂質過氧化和鐵死亡中起核心作用，連p53轉錄的間接作用也被拉來佐證這一論點。儘管如此，非酶促派多項研究的無情質疑致使LOX家族在鐵死亡的主導地位不穩。首先，敲除ALOX15並不能挽救GPX4缺失引起的鐵死亡及其嚴重病理後果。其次，對多種LOX亞型（5-LOX、p12-LOX和15-LOX-1）過表達的研究指出，無論LOX對PLOOH的原初蓄積有等何貢獻，脂質的非酶促自氧化才是鐵死亡的真正誘因。主張非酶促驅動的研究稱，氫過氧化物（LOOH）的臨界水平（約20 μM）可能是多種細胞系中鐵死亡發生的閾值，並提供了資料證明外源性補充脂質氫過氧化物至這一閾值即可提高細胞對RSL3誘導的鐵死亡的易感性，如5-、12-和15-氫過氧二十碳四烯酸中的任何一種。但酶促反應對於誘導鐵死亡的作用仍然是毋庸置疑的，因為如果沒有酶促的貢獻，PLOOH就可能無法達到臨界值，尤其細胞內還具備強大的抗氧化劑體系以隨時清除PLOOH。非酶促派也必須承認，LOX某些亞型或細胞色素P450氧化還原酶（POR）的缺失的確可以明顯緩解GPX4缺乏引起的不良後果。

鐵在參與脂質過氧化上非常積極，但是它如何促成這一過程仍然難以評估。含鐵酶促的活性依賴鐵的參與，鐵也可以透過芬頓反應促進脂質的非酶促自氧化。反正不管哪種方式，鐵螯合劑都是阻擋脂質過氧化和鐵死亡的不二法寶——至少在細胞環境中是這樣。

三個大錦囊，抵禦鐵死亡

Jiashuo Zheng, Marcus Conrad,

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.10.011

一、胱氨酸/GSH/GPX4系統：

永遠的大佬

我們曾一度認為胱氨酸/GSH/GPX4系統是防禦鐵死亡的唯一主要手段，而且基因敲除和抑制GPX4活性仍然是引發鐵死亡最經典的方法。GPX4是一種硒蛋白，其生物合成依賴於硒代半胱氨酸（Sec）的共翻譯整合機制。敲除這一至關重要的活性位點會導致小鼠胚胎死亡，而用半胱氨酸代替Sec的小鼠在斷奶前就會自發癲癇並死亡。

GPX4有三種同工酶（線粒體，細胞核和細胞質），但只有細胞質GPX4是胚胎髮育和抵抗鐵死亡所必需的，它被認為是管家酶，其表達受一般轉錄因子（如刺激蛋白1、核因子Y和AP2）控制。最近的一項研究進一步提出，GPX4 mRNA的表達受整合素α6β4的正向調控，但其潛在機制仍有待探索。此外，熱休克蛋白Hsp90可透過抑制GPX4蛋白降解而緩解鐵死亡。

最近有兩項研究發現一些奇怪的現象，即便在GPX4功能健全的情況下，p53-ALOX12訊號或α-硬脂酸酯仍誘導了鐵死亡的發生，但目前尚不清楚LOOH如何逃脫了GPX4的偵查。

二、NADPH/FSP1/CoQ10系統：

跨界選手

FSP1屬於II型NADH:醌氧化還原酶NDH-2家族，是傳統線粒體呼吸系統的一個分支，催化與複合體I同樣的反應，只是不泵送質子。基於與凋亡誘導因子AIF的結構同源性，人們認為FSP1能在某些情況下誘導凋亡，但其潛在機制尚不清楚。

FSP1被發現主要定位於脂滴和質膜，是一種清除有害脂質過氧化物的系統。從機制上講，線粒體外泛醌被FSP1從CoQ10還原而來，既可直接捕獲脂質自由基，也可以透過回收α-生育酚來間接充當抗氧化的角色。儘管FSP1最初被描述為p53反應基因，但最近的研究顯示p53的啟用卻並非是FSP1表達上調的必經之路。FSP1的表達和活性還存在著許多未解之謎，希望不會比蒙娜麗莎的微笑更令人琢磨不透。

三、GCH1/BH4/DHFR系統：

嶄露頭角

一項新鮮出爐的研究透過CRISPR全基因組篩選並確定了一種不依賴於GPX4的鐵死亡抑制基因，即鳥苷三磷酸環水解酶GCH1，它是合成四氫生物蝶呤BH4的限速酶。BH4是一種頗具實力的自由基捕獲抗氧化劑，但它的回收再利用需要二氫葉酸還原酶DHFR的參與，因此如果阻斷二氫葉酸還原酶DHFR，則可協同GPX4抑制劑發揮誘導鐵死亡的作用。

除此以外，BH4還可以透過將苯丙氨酸轉化為酪氨酸來促進CoQ10的合成，這是它發揮抗氧化作用的另一種方式。目前，GCH1/BH4/DHFR系統在鐵死亡中的潛在生理和病理作用還有待進一步研究。

鐵死亡與人類疾病：無處不在

Jiashuo Zheng, Marcus Conrad,

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.10.011

一、鐵死亡與退行性疾病

由於缺乏強有力的生物標誌物，鐵死亡與人類疾病之間的聯絡仍未得到很好的闡述。我們暫且只討論GPX4基因敲除的小鼠以及其他具備鐵死亡特徵的病理模型。除了前文提到過GPX4的缺失導致早期胚胎死亡，肝細胞或神經元中GPX4的特異性敲除也會導致圍產期或出生後死亡。他莫昔芬誘導的GPX4神經元特異性敲除會導致神經退行性病變和行為功能障礙。腎小管被證明是除大腦以外對鐵死亡最敏感的器官。條件性敲除GPX4的其他型別的細胞也都表現出功能缺陷或細胞死亡。

GPX4單基因敲除的小鼠模型極具研究價值，它可模擬GPX4活性降低，但功能又不至於完全喪失，這可能更加貼合臨床的實際情況。這種模型小鼠可以健康長大，只是接受刺激時會出現更為嚴重的病理變化，例如高糖高脂飲食導致的代謝紊亂、博萊黴素引起的肺纖維化、阿黴素引起的心肌病以及澱粉樣前體蛋白過表達導致的澱粉樣變性等。

在疾病模型中驗證鐵死亡的干預手段將有助於我們更好地理解鐵死亡參與到這些疾病中的作用。事實上，脂質過氧化和鐵蓄積是許多神經退行性疾病的特徵，包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、佩梅病、肌萎縮側索硬化症、多發性硬化症和弗裡德賴希共濟失調。鐵死亡抑制劑已經被證明能夠多種動物模型的組織損傷，如腦、心臟、腸、腎臟、肝臟和缺血/再灌注相關病理變化等。

二、鐵死亡與腫瘤抑制

研究顯示鐵死亡誘導劑對抑制幾種型別的癌症特別有效，包括三陰性乳腺癌，瀰漫性大B細胞淋巴瘤，腎臟和卵巢透明細胞癌，胰腺導管腺癌、肝細胞癌、神經母細胞瘤、腎上腺皮質癌、順鉑耐藥頭頸部癌和耐藥急性髓系白血病。在腫瘤當中以黑色素瘤較為特殊，因其細胞的分化狀態與對鐵死亡誘導劑的敏感性之間似乎存在負相關。

在接受免疫、放療和化療的癌症患者中也檢測到了鐵死亡。CD8+T細胞分泌的干擾素γ被證明能抑制SLC7A11的兩個亞單位，從而增加癌細胞對鐵死亡的敏感性。而存在於發生鐵死亡的腫瘤細胞上的鈣網蛋白也能促進樹突狀細胞的成熟和細胞毒性T細胞的浸潤。放射治療和免疫治療甚至可以聯手以一種獨立的機制抑制SLC7A11。

一方面，鐵死亡誘導劑已被證明可以增強放療的抗腫瘤作用，另一方面，鐵死亡抑制劑也可開發用於緩解放療引起肺損傷/纖維化和骨髓型放射病。因此，如何調節鐵死亡通路，從而在放射治療中獲得最大的臨床效益是一個值得進一步研究的關鍵問題。

除此之外，鐵死亡也被發現是現有化療藥物細胞毒性的主要死亡機制，如六甲蜜胺、索拉非尼和柳氮磺胺吡啶。此外，erastin聯用順鉑可增強抗癌功效。然而，值得注意的是，鐵死亡也會加劇順鉑誘導的急性腎損傷和阿黴素誘導的心肌病，因此聯合用藥還需謹慎三思。