動物腸道菌群的晝夜節律性及其與宿主間代謝互作的研究進展
腸道菌群的晝夜節律性及其與宿主間代謝互作的研究進展
摘要：腸道菌群具有24 h晝夜節律並與宿主生物鐘之間存在複雜的相互作用。當腸道菌群晝夜節律紊亂，會造成體內產生一系列生理和病理的改變；而當宿主的晝夜節律破壞，還會引起腸道菌群節律發生變化。本文主要綜述腸道菌群的節律特徵、影響因素、腸道菌群節律與宿主生物鐘的雙向作用及其相互關係，以期為研究腸道菌群節律及其與宿主生物鐘相互作用的代謝機理提供參考。關鍵詞：腸道菌群；晝夜節律；宿主；代謝互作
生物鐘(circadian clock)系統是生物在進化中為了適應晝夜更替對生物體的影響而形成的內在的適應性計時機制；晝夜節律(circadian rhythm)是生命活動以24 h左右為週期的變動，是機體生物鐘系統中的重要組成部分，能夠與機體的代謝同步變化。正常生物體的腸道內寄生著複雜的腸道菌群，在生物的生長髮育、消化吸收、代謝及免疫等方面起著重要作用。越來越多的研究表明，腸道菌群存在晝夜節律性，並存在宿主生物鐘系統和互動效果之間的一定的平衡時鐘。同時，肥胖等代謝類疾病也與晝夜節律紊亂有關，試驗進一步證實碳水化合物、脂類等營養物質的代謝與宿主生物鐘存在密切聯絡，同時晝夜節律紊亂也會使肝臟生物鐘紊亂；生物鐘紊亂則會破壞腸黏膜屏障，升高腸黏膜通透性，促進炎症反應，增加脂肪肝發生率。研究發現，宿主生物鐘和菌群生物鐘可以根據它們的飲食和可用性共同進化，破壞宿主生物鐘，可導致菌群生物鐘的改變，影響腸道菌群的構成。本文主要綜述了腸道菌群有節奏的生物鐘及其與宿主生物鐘系統的互作效應，以期為今後腸道菌群與其宿主節律相互作用影響代謝機制的研究提供一些參考資料。
1、腸道菌群的晝夜節律性
最早發現藍藻菌和真菌具有對光的晝夜節律性，其代謝水平的節律主要受緯度(光照時間)的影響，該結果首次證實了細菌存在晝夜節律性，但尚不清楚腸道菌群作為一個重要的生物群落是否存在晝夜節律性。Thaiss等透過對小鼠時差的控制證明了腸道菌群的組成和功能存在24 h週期的日變化；隨後，Leone等研究發現腸道菌群的日變化受攝食時間影響。隨著對腸道菌群研究的繼續，發現腸道菌群確實具有以24 h為1個週期變化的晝夜節律。此晝夜節律主要表現在3個方面：數量與組成、定植位置和功能活動。
1.1 腸道菌群構成與數量的晝夜節律性
腸道菌群高度動態，且表現出24 h的晝夜變化。目前研究發現，生物鐘的分子機制是一個24 h自動調節的反饋機制，涉及晝夜節律突變基因包括Per、Clock、Bmal1和Tim等。反饋迴路以Clock/Bmal1在E-box上耦合形成二聚體為起點，接著啟用啟動子，誘導Per、Cry轉錄翻譯，使Per、Cry蛋白濃聚形成二聚體，從而實現反饋抑制。此外，還發現Tim蛋白會與Per蛋白結合，隨後一起進入細胞核，從而抑制Per的活性，這樣便使抑制反饋迴路閉合成環。Rosselot等以失活ClockD19等位基因的純合小鼠作為研究晝夜節律基因破壞的模型，發現該小鼠腸道細菌的豐富性和均勻性明顯降低，ClockD19突變能使得晝夜節律破壞，導致腸道生態失調。Liang等在研究哺乳動物腸道菌群時，發現其中擬桿菌門和厚壁菌門的丰度均表現出晝夜節律性，可以假定小鼠腸道菌群數量和種類呈週期性波動，隨後敲除Bmal1基因，腸道菌群的結構組成和數量均失去晝夜節律性。Thaiss等研究透過對小鼠光照時間和飲食時間的調節，發現類屬於梭菌目、乳桿菌目以及擬桿菌目的菌群丰度具有晝夜節律，這些菌群約佔15%。透過數量測試，發現擬桿菌數量的晝夜波動是腸道菌群組成晝夜節律性變化的主要驅動力，並透過腸道菌群日變化的數量和型別的定量法進一步證實腸道菌群的數量及種類具有晝夜變化。
1.2 腸道菌群定植的晝夜節律性
微生物定植是指微生物從不同環境進入機體，並在某部位定居，繼續生長和繁殖的過程。微生物定植後，需要生物體提供營養物質來維持正常的生長髮育和繁殖；微生物的定植受環境、定植抗性等因素的影響。在對池塘細菌分佈及日變化規律研究中，發現池塘水細菌的差異在白天逐漸增大，在夜晚逐漸減小，說明白天更利於細菌的定植、生長和發育。實時熒光定量PCR檢測健康男女早晚形成的鏈球菌牙菌斑定植變異數量的差異，結果發現白天12 h定植變異體鏈球菌數小於夜間12 h，表明牙菌斑微生物定植存在晝夜節律變化。
以上均表明細菌的定植的確具有晝夜節律變化，為此對腸道菌群的定植晝夜變化也做了探討。Thaiss等報道，腸道菌群的定植具有由於晝夜交替導致微小的位置移動，它們有著自己的習慣，從部分腸黏膜定植開始，向左或向右移動幾微米，隨後再返回原位置。採用實時熒光定量PCR擴增檢測和電鏡觀察，發現菌群在腸黏膜層定植程度呈24 h週期性變化。研究發現，晝夜期間腸上皮細胞和菌群的空間位置不同，而腸道菌群的構成，甚至菌群及宿主的功能交流會受到這種位置的晝夜節律影響。但是對於這一方面的研究目前還比較少，腸道菌群定植位置節律究竟還有怎樣的具體變化，哪些菌群表現出強烈的位置變化，這種變化對機體有哪些影響，這些問題都有待解決。
1.3 腸道菌群功能活動的晝夜節律性
研究人員針對微生物群組成的晝夜變化是否對1 d內腸道菌群的功能活動產生影響進行了探討。研究發現，齧齒類動物晝夜期間腸道菌群含量會發生變化，從而導致菌群的功能活動也有所不同，比如白天這類動物通常處於休眠期，由於腸道中乳桿菌數量較多，機體解毒、胃腸蠕動、感知環境這些作用增強；相反在夜間由於厚壁菌和擬桿菌含量的增加，DNA恢復、能量代謝和細胞生長及發育作用增強，如果強行改變飲食習慣，腸道菌群數量、型別以及活動方式將改變。大多數基因在1 d內表現穩定，對光暗迴圈期間收集的小鼠糞便進行宏基因組測序，並將基因組序列對映到腸道菌群基因目錄，發現某些基因組的數量(如涉及鞭毛組裝和糖胺聚糖降解的基因)差異較大。試驗發現，有基因覆蓋在0.2以上的通路中，其中23%具有晝夜週期節律性，結果表明存在特定時間的微生物群功能。此外，不同的功能單元似乎表現出反相協調的波動，例如，參與DNA修復、能量代謝和在黑暗中良好表現的細胞生長的功能，而在光明期表現出更多的“維持”途徑參與解毒、運動和環境意識。總之，這些結果揭示了微生物區系的組成及功能存在遵循24 h節律的晝夜波動，並能夠導致在具體時間的強烈振盪。
2、腸道菌群晝夜節律性的影響因素
2.1 宿主進食節律影響腸道菌群節律性
在哺乳動物中，食物訊號是環境中最有效的生物鐘授時訊號之一。分類學分析表明，有節奏的進食可導致微生物群振盪的發生，某特定種類的微生物有節奏地佔據生態位可能是這種宏基因組波動的原因，而這些生態位可對進食或者飢餓階段做出迴應。因此，外來微生物進入腸道菌群是每日波動的基礎，導致共生菌群需要一個晝夜節律的生態位佔領。一些試驗研究發現，菌群節律能夠透過調節飲食節奏進行調控。對Per1、Per2基因敲除的小鼠給予長期節奏性的飲食後檢測菌群的構成發現，調控進食節律可恢復由於宿主節律被破壞而引起的菌群失調；同時，Thaiss等的研究也顯示，Per1、Per2基因敲除的小鼠可以透過恢復進食節律從而促進腸道菌群晝夜節律性的恢復；Zarrinpar等研究結果顯示，可以透過限時餵養恢復由於飲食問題導致肥胖的小鼠某些菌群的節律性波動。飲食習慣可為正常野生型宿主體內的微生物群的節律提供動力，比如夜間齧齒動物會在黑暗期首先進食。相比之下，Per1和Per2基因敲除小鼠的晝夜進食節律明顯較弱，所以它們微生物組節律的減弱是其改變進食時間所導致的。為此，研究者進行了一個定時餵食試驗，野生型小鼠只在光明或黑暗期進食，結果發現，與定時餵食對外周時鐘的嵌入能力相一致，這種餵食習慣改變腸道生物鐘基因的表達模式。大部分迴圈的操作分類單元(OTUs)在改變進食時間後相對移動約12 h，表明進食時間可以直接控制微生物群的節律。這些結果表明，進食時間影響微生物群落構成的波動，而共生菌丰度的波動可以透過規律飲食來調節。此外，不同微生物的能力可以藉助進食節律，主要是進食節律對營養物質運用程度的改變進行調節，微生物的細胞發育、能量汲取和DNA損傷後的反應功能主要在營養素可消化吸收時期，解毒功能主要在非進食期間。
2.2 宿主飼糧結構影響腸道菌群節律性
飼糧組成的改變會引起腸道菌群的構成、功能改變，同時也會使其晝夜節律波動受到影響。Leone等研究發現，將試驗小鼠持續置於“人工晝夜”中，餵食低脂或高脂飲食的無菌(germ-free，GF)小鼠的中樞生物鐘基因和肝臟生物鐘基因表達明顯受損，但與低脂飼糧相比，高脂飼糧使小鼠微生物alpha多樣性(一個特定區域或生態系統內的多樣性，是反映菌群豐富度和均勻度的綜合指標)改變，Shannon指數(Shannon指數越高，說明菌群的多樣性越高)顯著降低；對低脂飲食小鼠和高脂飲食小鼠的盲腸菌群beta多樣性(能夠反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異)深入評估表明，在低脂飲食條件下，1 d之內，授時因子時間變化更明顯；此外，定量PCR(qPCR)測定的16S rRNA丰度的振盪僅在高脂飲食小鼠的盲腸內容物中檢測到，即小鼠菌群丰度的晝夜節律受到抑制主要是在高脂飲食條件下，說明高脂飲食對腸道菌群晝夜節律存在影響。此外，高脂飲食小鼠腸道菌群晝夜節律振盪消失，晝夜差異顯著的菌群數量減少，夜間有益菌類數量減少，有害菌類數量增加。但是，先前沒有發現晝夜節律性的硫酸鹽還原菌，卻能夠在小鼠餵食高脂飲食時表現出晝夜節律性；有時間限制的高脂飲食的小鼠可以部分使腸道菌群的晝夜節律性恢復原水平，恢復葡萄糖正常耐受量，並抑制小鼠肥胖。上述結論均說明飲食特別是高脂飲食能夠對腸道菌群晝夜節律以及宿主代謝功能產生重要影響。
2.3 性別影響腸道菌群節律
性別的差異會使機體的很多方面產生差異。例如，雌性C57BL/6成年小鼠心肌細胞收縮力和鈣瞬變普遍低於雄性；小鼠化學性肝損傷的過程中，雄性小鼠肝損傷後的修復能力相比雌性小鼠比較強；短期高脂飲食對不同性別的小鼠腸道菌群組成以及結構的影響也存在差異。
已知宿主生物鐘的變化會影響腸道菌群，推測不同性別的宿主生物鐘變化對腸道菌群的影響有所不同。研究發現，小鼠糞便菌群晝夜節律性消失時，雌雄兩者菌群丰度的改變不同。Org等研究發現，使用睪丸素能夠恢復缺失睪丸小鼠的腸道菌群中由於睪丸切除造成的變化及膽汁酸構成中的反向性別差異，這說明雄激素對腸道菌群的變化起作用。而睪丸素等類固醇的生成依靠生物鐘蛋白Bmal1。所以，睪丸素和膽汁酸等激素可能與宿主不同性別產生的不同腸道菌群有關，而生物鐘和性別兩者間的互作對腸道菌群的構成和晝夜節律也有重要影響。
3、腸道菌群與宿主生物鐘的相互作用
腸道菌群在結構組成和功能上呈現出晝夜節律性，並經由腦-腸軸影響大腦神經生化和行為表型。腸道菌群的晝夜節律性振盪受宿主進食節律、食物結構和性別的調節；而腸道菌群對宿主的節律波動蛋白轉錄、表型遺傳以及代謝也有顯著的系統性影響。這些均表明腸道菌群與宿主生物鐘之間相互作用，不可分割。
3.1 腸道菌群對宿主生物鐘的調控作用
宿主生物鐘的正常運作作為腸道菌群晝夜節律性變化的依賴，宿主生物鐘和腸道菌群兩者任一方的紊亂都會對另一方產生不利影響，比如生物鐘紊亂導致腸道菌群失調，而腸道菌群紊亂也會導致生物鐘改變。研究發現，破壞腸道菌群的穩態直接影響宿主基因的節律性表達。Kuang等研究證明，腸道菌群調節小鼠小腸晝夜節律的關鍵物質是組蛋白去乙醯化酶3(HDAC3)。HDAC3透過集合微生物、整合晝夜節律線索來調控宿主晝夜節律性，並確定了控制宿主代謝的關鍵機制。Leone等透過檢測GF小鼠和無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級小鼠視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)生物鐘基因的表達程度，發現在同等光照條件下腸道菌群失調能夠改變生物鐘基因表達，表明腸道菌群對宿主生物鐘基因表達的維持有重要作用，其中腸道菌群的結構及組成改變會影響生物鐘基因調控網路的平衡，由此影響代謝平衡並引發病理改變。
中央生物鐘協調周圍組織的生理活動，使外周組織能夠適應外部環境的需要，同樣機體的中樞生物節律透過各種神經和體液訊號協調外周生物節律。研究發現，腸道菌群與外周生物鐘也密切相關。腸道作為機體最重要的免疫器官，其主要成分腸道菌群的結構和功能與腸黏膜免疫功能的晝夜節律性有密切聯絡。研究發現，GF小鼠的盲腸和結腸上皮細胞的核受體、生物鐘基因的表達譜表達與正常上皮細胞不同。此外，對於肝臟的外周生物鐘，比較GF小鼠與SPF小鼠的肝臟生物鐘基因(Bmal1、Rev-erbα、Rev-erbβ、Per1、Per2、Cry1)的mRNA翻譯方式，結果發現兩者顯著不同；高脂飲食的小鼠腸道菌群代謝產物的平衡穩態將會消失，肝細胞內Per2和Bmal1基因節律性表達也有影響；透過小鼠肝臟對過量的乙醯氨基酚的解毒效果比較發現，早晨和傍晚的毒性差異明顯，主要是腸道菌群產生的代謝產物水平存在晝夜節律性，這種節律改變了小鼠肝臟中編碼代謝酶的基因表達。這些結果都表明肝臟生物鐘節律、宿主器官晝夜節律活動均與腸道菌群節律有關。目前一項研究指出腸道菌群定期的運動會將腸道組織與不同的微生物或代謝產物接觸，改變宿主的晝夜節律性。
3.2 宿主生物鐘對腸道菌群的調控作用
腸道菌群的影響因素有年齡、飲食、藥物、體質等，其中也包括宿主生物鐘的調控。宿主晝夜節律紊亂引發的腸道菌群紊亂，能夠直接影響腸道的免疫和營養代謝功能。上文論述了腸道菌群對中樞生物鐘及外周生物鐘的調控，反之這兩者對腸道菌群調控也有著重要作用。小鼠生物鐘基因Per1和Per2敲除試驗發現，宿主生物鐘紊亂將引起菌群改變，菌群改變導致腸道菌群晝夜節律改變，直接說明腸道菌群的晝夜節律受到宿主生物鐘基因的調控。Oh-Oka等透過比較生物鐘阻遏蛋白基因Per2突變型小鼠和野生型體內閉合蛋白(occluding)和密封蛋白-1(claudin-1)的mRNA的表達水平以及結腸通透性的差異，發現中樞生物鐘紊亂的小鼠腸上皮屏障均被破壞，腸道通透性增強，間接說明生物鐘紊亂能引起腸道菌群的紊亂。此外，中樞生物鐘可透過調節生物鐘基因表達實現對外周生物鐘的調節，如肝臟、胰腺和腸道生物鐘也會導致腸道菌群節律紊亂。研究還發現糖尿病與胰腺生物鐘功能損傷有密切關係，在胰腺生物鐘網路及糖尿病相互作用下，腸道菌群發生不同的失調，導致病情加深。近年來的研究發現，褪黑素是宿主生物鐘對腸道菌群組成(例如降低厚壁菌門與擬桿菌門的比例)造成改變的重要調節因子，褪黑素能夠影響腸毒素大腸桿菌在宿主腸道中的定植。
4、腸道菌群與宿主生物鐘互作對代謝的影響
晝夜節律對宿主各個代謝有重要影響，在代謝過程中，腸道菌群的晝夜波動也是重要組成。宿主和腸道菌群之間的互作對於宿主代謝穩態十分重要，這種節律一旦失去調控，可能導致肥胖、代謝紊亂及其他綜合病症。因此，宿主節律與腸道菌群的相互作用是代謝類疾病的一個重要突破，能夠為其提供新的切入點。已有研究發現，這種互作能夠對免疫和營養代謝等方面產生影響。
4.1 免疫應答
腸道是機體最大的免疫系統，對人或對動物的免疫功能都起著重要作用。生物鐘能夠改變腸道通透性，突變的宿主生物鐘基因引發腸黏膜通透性升高，從而使腸道菌群失調，最終加重脂代謝紊亂，增加脂肪肝的發生率；給予小鼠高脂高糖飲食且晝夜顛倒，對其結腸生物鐘基因檢測和糞便進行16S rRNA測序，分別發現了Per2表達的晝夜節律變化及腸道菌群的構成和結構變化；生物鐘基因Bmal1具有抗炎作用，所以缺失了生物鐘基因Bmal1則會導致菌群向致炎表型改變。以上結果均表明宿主生物鐘紊亂將導致菌群紊亂，進而發生代謝類疾病。此外，腸道菌群的晝夜節律紊亂會改變宿主生物鐘基因的轉錄產物集合，破壞血清中氨基酸和多胺類等代謝產物的穩定，並影響肝臟的解毒功能，這直接說明腸道菌群紊亂導致肝臟生物鐘基因表達的改變，進而導致肝臟生物鐘紊亂和代謝功能的破壞。綜上所述，菌群節律性與宿主節律性的互作對機體免疫起著重要作用。
4.2 養分代謝
營養物質的正常吸收和消化對機體具有重要作用，一旦這種平衡態，主要是腸道菌群與宿主間的平衡被打破時，代謝類疾病的發生和發展就更容易。研究發現，腸道菌群主要是透過鞭毛蛋白和脂多糖(LPS)啟用髓樣分化因子88(MyD88)釋放白細胞介素-23(IL-23)，然後刺激3型天然淋巴細胞(ILC3)釋放白細胞介素-22(IL-22)，接著啟用細胞通訊的傳導過程及轉錄啟用蛋白3(STAT3)，實現對宿主生物鐘的調控，進而使節律基因Nr1d1的轉錄活性抑制，使腸道菌群進入腸道內壁細胞並改變細胞的生物鐘功能，從而實現機體對脂肪的攝入和儲存的調節。同時，進食節律性改變會導致腸道菌群組成改變，可以透過降低擬桿菌門含量、增加厚壁菌門含量增加肥胖發生率。最近有研究發現，菌群、晝夜節律和宿主新陳代謝之間的重要橋樑就是作為腸道關鍵代謝活動中樞的蛋白質白細胞介素3調節核因子(NFIL3)。腸道菌群產生鞭毛蛋白和LPS調控NFIL3晝夜迴圈，繼而對脂肪代謝通路的晝夜節律進行調控，反之，腸道菌群紊亂引起的宿主生物節律改變，使得NFIL3表達下調從而導致脂質代謝紊亂。Govindarajan等研究發現，腸道菌群的膽鹽水解酶(BSH)等代謝產物具有參與腸道及肝臟生物鐘調控的可能性，還能夠透過膽酸代謝作用於宿主的晝夜節律，此外，BSH憑藉“腸肝迴圈”作用於宿主的脂類和膽固醇的消化吸收。以上結果表明，宿主生物鐘與腸道菌群互作平衡對養分的正常代謝有著重要的作用。
5、小結
對腸道菌群的調控因素研究目前已經大致掌握，但其內在機制及具體如何影響不夠清楚，而是否還有其他影響因素也值得探索。研究腸道菌群的晝夜節律性及其與宿主間代謝互作可為代謝類疾病的研究提供新的起點，但由於菌群失調導致的宿主病理狀態下腸道菌群的節律產生變化的機理如何，仍是未來我們需要研究的方向。毋庸置疑的是，無論是動物還是人類代謝類疾病的研究發展，腸道菌群晝夜節律性的研究都是一個非常重要的切入點。
個人意見，僅供參考