生物工程纖維軟骨組織以恢復半月板功能的先進策略是醫學的迫切需要。目前，生物3D列印技術已被用於製造與臨床相關的患者特定的複雜結構，以滿足臨床需求。在本研究中，透過將載細胞結冷膠/纖維蛋白原(GG/FB)複合生物墨水和絲素蛋白甲基丙烯酸化(SiL-MA)生物墨水以交錯圖案的方式共同列印，製備了一種用於纖維軟骨再生的高彈性複合結構。研究團隊透過測量生物墨水的流變效能、溶脹度和壓縮力學行為來表徵每種生物墨水配方。為了進行體外生物學評價，分離豬原代半月板細胞(pMCs)，並將其懸浮在GG/FB生物墨水中進行列印。結果表明，GG/FB生物墨水提供了良好的細胞微環境，可維持細胞的活力和增殖能力以及生物列印構建物種pMCs的成熟，而SiL-MA生物墨水具有良好的生物力學行為和結構完整性。更重要的是，這個生物列印的雜交系統顯示了在移植後10周的小鼠皮下植入模型中纖維軟骨組織的形成，而沒有尺寸變化。特別是，膠原纖維的排列是在生物印染的雜化結構中實現的。結果表明，這種生物列印的機械增強的複合結構為生產先進的纖維軟骨組織提供了一種通用並且有前途的替代方案。
纖維軟骨主要見於膝關節的半月板、顳下頜關節和椎間盤纖維環。半月板是無血管的，導致內在再生能力差，損傷往往導致退行性疾病。由於半月板組織退行性變的患者數量增加，關節鏡下半月板部分切除術是最常見的骨科手術之一。因此，迫切需要先進的生物工程策略來構建纖維軟骨組織。
生物3D列印技術為患者特定結構的生物製造提供了有前途的和通用的選擇。這是透過在單個組織結構中精確地沉積多種成分，包括細胞和生物材料(也稱為生物墨水)來實現的。生物墨水提供了一個3D網路，能夠模擬體內的微環境，以支援細胞的粘附、增殖和分化。此外，列印結構的功能和生物力學特性可以透過生物墨水組合物進行調節。因此，生物列印的組織結構應該提供組織特異性的生物力學和生物微環境，以確保列印後的細胞表型和成熟。在可列印性、細胞封裝能力和活性、結構物理效能(即降解、結構保持等)的控制以及組織特定功能的機械行為之間不斷進行折衷，以實現預期的結果。
一些天然和合成的生物材料，如纖維蛋白原(FB)、明膠、海藻酸鹽、透明質酸(HA)、膠原蛋白、聚己內酯PCL)、和聚乙二醇(PEG)已被廣泛用於3D組織結構的生物製造中，在某些情況下，它們一起用於改善生物墨水的特性。此外，已經提出了混合系統以實現生物和機械效能。例如，天然衍生的水凝膠用作細胞載體材料，而合成的熱塑性聚合物用作支援結構材料。然而，基於水凝膠的生物墨水受到結構完整性差、機械穩定性差、可列印性差以及快速降解速率的限制。同樣，合成聚合物不能提供適當的生物微環境。這可能導致細胞粘附力降低，從而導致植入物生物相容性較弱。此外，這些合成聚合物表現出緩慢的降解和不適當的機械硬度。目前正在引入更先進的生物墨水系統來克服這些當前的挑戰；然而，儘管生物列印技術有了顯著的改進，挑戰仍然存在。
對於纖維軟骨組織的再生，生物墨水應該提供合適的細胞微環境和生物力學穩定性，以支援印刷細胞對組織特異性細胞外基質成分的穩定沉積。尤其是，生物墨水應該能夠承受半月板修復過程中的迴圈壓縮負荷。
為了滿足所有這些要求，João B. Costa團隊開發了一種新型的3D複合組織結構。透過依次將含有豬半月板細胞(pMCs)的細胞結冷膠(GG)和含有豬半月板細胞(PMC)的FB複合生物墨水(圖1A)和絲素蛋白甲基丙烯酸酯(SiL-MA)生物墨水(圖1B)共列印，以用於纖維軟骨組織的再生。
圖1.生物列印複合組織結構的生物墨水配方示意圖。(A)GG和FB複合生物墨水，透過離子和酶交聯形成穩定的水凝膠。(B)透過與MA反應，用甲基丙烯酸酯基團對SF進行化學改性，生成SiL-MA。
研究團隊假設，載細胞的GG/FB生物墨水將提供細胞活動和組織形成所需的生物微環境，而SiL-MA生物墨水將提供3D列印過程所需的機械支援和穩定性，以及列印組織構建物的結構完整性和力學效能。透過測量細胞活性、增殖和體外成熟來檢測生物列印的雜交組織結構，並使用小鼠皮下植入模型驗證纖維軟骨組織的形成、組織和尺寸維持。
GG/FB複合生物墨水的製備與表徵。對6種不同濃度的FB(1、2、3、4、5和6 mg/mL)與GG混合進行了流變學評價(表1)，並以GG單獨作為對照。在不同頻率和低應變下的振盪測量表明，所有GG/FB生物墨水配方之間沒有顯著差異(圖S1)。GG/FB複合生物墨水主要表現為彈性行為(G‘>G“).。此外，所有生物油墨配方都表現出剪下變稀行為，這在基於擠壓的生物列印中是至關重要的(圖2A)。
圖2.GG/FB生物墨水的材料特性和體外生物學評價。(A)不同FB濃度的GG/FB生物油墨交聯前的粘度和(B)交聯後GG/FB水凝膠的壓縮彈性模量。(C)僅在GG和GG/FB4載體中列印的pMCs在培養1、3、7和14天顯示活力的活/死染色影象，活細胞以綠色染色，死亡細胞以紅色染色(比例尺：200μm)。(D)經AlamarBlue實驗證實，印刷的PMC在GG和GG/FB4載體中的代謝活性在,培養的第1、3、7和14天的GG和GG/FB4結構中列印pMCs的代謝活性。在培養14天和28天時，定量測定GG單獨和GG/FB4構建中(E)膠原和(F)GAG的產生。(G)培養28天后生物列印的GG和GG/FB4結構的非極化(左)和極化(右)印跡印記的GG和GG/FB4結構的印跡紅染色影象(比例尺：50μm)。*p<0.5，**p<0.0 1，*p<0.001，差異有統計學意義。對照組為單純GG組，不加FB組。
為了評估生物墨水的生物學效能，包裹細胞的細胞外基質沉積也是一個需要解決的重要特徵。纖維軟骨是一種高度包埋在細胞外基質(ECM.39，40)內的無血管和神經組織，因此，ECM沉積的存在是被包裹的pMCs細胞功能的一個指標。當包裹在GG/FB4生物墨水中時，與單獨使用GG生物墨水相比，pMCs在體外培養28d後顯示出更多的膠原(*p<0.001.0 5，圖2E)和GAG(*p<0.0 5，圖2F)。有趣的是，在GG/FB4生物墨水結構的表面區域發現了軟骨膜樣膠原沉積，而GAG的產生髮生在整個結構區域(圖2G和圖S2)。
纖維軟骨組織的特徵是存在於承受較大壓縮和拉伸載荷的人體區域。儘管GG/FB4結構具有更好的力學效能和結構完整性，但其力學效能和穩定性不能滿足纖維軟骨再生的要求。在此，我們開發了SiL-MA生物墨水，為生物工程纖維軟骨組織構建提供更好的力學效能和結構完整性。製備了三種不同甲基丙烯酸化程度的SiL-MA基生物油墨。根據甲基丙烯酸縮水甘油酯用量的不同，得到了63.5%[SiL-MA(H)]、57.2%[SiL-MA(M)]和44.5%[SiL-MA(L)]的甲基丙烯酸縮水甘油酯用於進一步的實驗(圖S3)。
對於印刷過程，明膠引入了熱敏效能，而甘油則提高了分配均勻性，防止了噴嘴堵塞.8流變測試表明，SF的化學修飾沒有影響生物油墨的流變行為，這些SiL-MA生物油墨表現出所需的彈性(G‘>G“)和剪下稀化行為(圖3A和圖S4A，B)。
圖3.SiL-MA生物墨水的材料表徵和體外生物學評價。(A)不同甲基丙烯酸酯度的SiL-MA生物油墨的粘度。(B)在孵化第0、1、7、14天時發生構象變化。(C)在培養的0、1、7、14天，SiL-MA支架的壓縮彈性模量(*與SiL-MA(L)在0、7、14天相比P<0.05；*與SiL-MA(M)在1天時的壓縮彈性模量比較，以及**與其他三種材料的比較**p<0.05)。(D)不同甲基丙烯酸酯度的SiL-MA結構的掃描電鏡影象。(E)接種SiL-MA構建物的pMCs在培養第1、3和7天的活/死染色影象，活細胞以綠色染色，死細胞以紅色(比例尺：200μm)染色。(F)AlamarBlue實驗證實，接種於SiL-MA載體中的pMCs在培養的第1、3和7天具有代謝活性(N.S.：不顯著)
結果表明，儘管印刷過程中使用了不同程度的甲基丙烯酸甲酯，但流變行為高度依賴於明膠和甘油，因為明膠和甘油提供了適當的可列印性。最終，這些基於SiL-MA的生物墨水配方可以列印3D組織結構，具有良好的列印保真度和易操作性。
研究團隊還在水溶液條件下測定了SiL-MA構象隨時間的變化。這些構象可以透過從無規捲曲到晶體構象(β-Sheet)的自發構象變化來檢測。在本研究中，透過紫外光曝光的光交聯過程也證實了SiL-MA構象的自發構象變化。透過改變甲基丙烯酸酯的程度，結果表明有可能調節構象變化的速率，以及隨著時間的推移機械效能的改善(圖3B，C和圖S4C)。
研究團隊測定了不同交聯度的Sil-MA結構的孔徑和溶脹率。掃描電鏡觀察顯示，與Sil-MA(M)和Sil-MA(L)構建物相比，SIL-MA(H)構建物具有更小的孔隙(圖3D)。此外，甲基丙烯酸酯度較高的SIL-MA結構的溶脹率較低(圖S4D)。為了評價Sil-MA生物墨水的體外生物學特性，將pMCs種植到Sil-MA構建物上。活性(圖3E)和代謝活性(圖3F)分析表明，所有Sil-MA生物墨水都支援細胞粘附，並在培養7天內保持代謝活性。在比較三種不同的Sil-MA結構時，沒有發現明顯的差異。
絲素增強複合組織構建生物3D列印的體外評價。在上述實驗的基礎上，選擇GG/FB4和Sil-MA(H)進行三維雜化纖維軟骨組織構建物的生物列印。與其他配方相比，GG/FB4生物墨水配方在保持生物特性的同時具有最高的壓縮彈性模量。
圖4.生物3D列印混合結構的壓縮力學效能。(A)生物印跡的SiL-MA(H)、GG/FB4和混雜結構在孵育0天和14天的應力-−應變曲線和壓縮彈性模量(*P<0.0 5與GG/FB4相比，**N.S.：無顯著性)。(C)3D生物列印的SiL-MA(H)和混合結構在壓縮測試下的外觀。生物印跡(D)、SiL-MA(H)和(E)雜化結構的壓縮迴圈應力−弛豫曲線。
圖5.3D生物列印雜交構建物的體內生物學特性。(A)用於生產3D生物列印構件的列印圖案方案以及植入後2、5和10周外植體的大體外觀。(B)植入後2、5和10周的三維生物列印結構的尺寸變化和(C)壓縮彈性模量(*p<0.05，**N.S.：無顯著性)
三維生物列印雜化構建物的體內纖維軟骨再生。為了驗證生物列印跡雜化構建物用於纖維軟骨再生的可行性，將構建物植入裸鼠皮下，分別於植入後2、5、10周取材。宏觀評估顯示，在植入10週期間，雜化結構保持了其原始尺寸，並且在SiL-MA(H)和雜化結構中觀察到了血管化(圖5A，B)。
組織學分析顯示，在GG/FB4和混合結構中形成了纖維軟骨樣組織(圖6A，B)。兩組GAG和膠原基質的產生分別用藏Safranin O染色和Masson‘s三色染色證實。定量顯示GAG和膠原基質的產生隨著時間的延長而增加(圖6C，D)。結果表明，植入後10周，複合支架的GAG含量(0.4±0.0 1μg/mg)和膠原含量(4.71±0.15μg/mg)均明顯高於其他支架。正如預期的那樣，無細胞的GG/FB4結構產生的細胞外基質較少，組織學分析僅顯示宿主組織浸潤(圖S5）。
圖6.生物3D列印雜化構建物的組織學和生化檢查。植入2、5和10周後(A)GG/FB4和(B)雜交構建物的3D生物列印的組織學影象(比例尺：200μm)。在植入後2、5和10周，定量測定生物印跡構建物(C)GAG和(D)膠原的產生；SiL-MA(H)、GG/FB4、雜交體和無細胞的GG/F4(*p<0.05與GG/FB4(-細胞)相比，**p<0.05與SiL-MA(H)相比，以及*p<0.05與其他組相比)
為了檢查膠原組織的成熟，研究團隊用阿Alcian Blue/Sirius Red進行了成像分析。染色後的標本在偏振光下觀察，分析膠原基質(圖7A，B)。
圖7.植入2、5和10周後，3D生物列印結構中偏振的PicroSirius Red染色的膠原纖維的定量。生物列印的(A)GG/FB4和(B)雜交結構(比例尺：100μm)的未偏振和偏振的Alcian Blue/Sirius Red染色影象。使用定製的MATLAB程式碼計算(C)GG/FB4和(D)混合結構中每種膠原纖維顏色的平均百分比。(E)典型偏振影象(比例尺：20μm)和(F)植入後10周和天然(豬半月板)生物列印結構的比對分析(*與GG/FB4，N.S.相比，P<0.05，無顯著性)。
以FB/GG為載體的生物墨水和絲素為基礎的生物墨水生物列印構建了纖維軟骨組織再生的組織結構。這些新型生物墨水配方提供了對細胞友好的生物微環境以及結構完整性。
體內研究表明，生物列印的雜化組織構建物能夠在植入後10周內保持其結構尺寸和足夠的生物力學效能，更重要的是，能夠使組織成熟和細胞外基質沉積類似於天然半月板組織。這些新型生物墨水的通用性和可調性表明，該系統可能用於需要機械增強組織結構的不同組織工程應用。