近日，美國UCSD的Chen Shaochen 教授等在Advanced Materials期刊上綜述了“Biomaterials and 3D Bioprinting Strategies to Model Glioblastoma and the Blood–Brain Barrier”， 詳細介紹了膠質細胞瘤和血腦屏障模型的生物材料和3D生物列印策略。

摘要：膠質母細胞瘤（GBM）是最流行和致命的成人原發性中樞神經系統癌症。免疫抑制性和高度異質性的腫瘤微環境，透過血腦屏障（BBB）限制化學療法或免疫療法的遞送以及大腦獨特的生化和解剖學特徵導致其普遍復發和不良預後。由於傳統模型無法預測GBM的療效，因此GBM和BBB的體外3D模型透過3D生物列印技術利用患者或健康個體來源的細胞和生物材料，可能會模仿GBM和BBB的基本生理和病理特徵。3D生物列印構建物能夠以物種匹配，高通量和可再現的方式研究細胞以及細胞與細胞外基質的相互作用，用作篩選或給藥平臺。這裡，提供了當前3D生物列印的GBM和BBB模型的概述，詳細介紹了GBM和BBB的微環境組成，模擬天然組織的相關生物材料以及實現模型製造的生物列印策略。總而言之，3D生物列印的GBM和BBB模型是有希望的系統和仿生替代品，可替代傳統模型，以進行更可靠的機理研究和臨床前藥物篩選，最終可能會加快GBM的藥物開發過程。

膠質母細胞瘤（GBM）是最常見和侵略性的成人原發性腦癌，佔所有惡性中樞神經系統（CNS）腫瘤的14.6％。在美國，患者的五年相對存活率為6.8％，在所有原發性惡性中樞神經系統腫瘤中排名最低。儘管在過去的幾十年中付出了巨大的努力，但對於GBM折磨的患者而言，其治療進展甚微。護理標準GBM的治療包括最大程度的手術安全切除，然後同時口服甲基化劑，替莫唑胺（TMZ）和輔助TMZ進行化學放療。以前嘗試過使用半開顱手術進行徹底的手術切除，但由於腫瘤細胞擴散侵入腦內並保留必要的腦功能，因此未能治癒。GBM細胞以不同的方式侵入腦實質，包括作為單個細胞，並充當復發的儲庫。GBM的廣泛分子譜分析已鑑定出反映異質腫瘤遺傳學和表觀遺傳學的獨特轉錄亞型。TME中的腫瘤細胞，基質細胞和細胞外基質（ECM）之間複雜的細胞和細胞-基質相互作用，導致動態和免疫抑制性GBM腫瘤生態系統對現有療法具有高度抵抗力。普遍復發，較高的腫瘤內和腫瘤間異質性以及複發性GBM對治療的耐藥性導致70歲以下（14.6個月）的患者預後較差，中位生存時間低下。與其他實體瘤相比，將治療劑輸送到GBM腫瘤尤為具有挑戰性，因為藥物和細胞透過大腦獨特的血管屏障血腦屏障（BBB）的運輸受到限制。BBB充當迴圈血液和腦實質之間的屏障，以防止血液傳播的病原體或有毒物質進入中樞神經系統並維持中樞神經系統的穩態。BBB排除了98％以上的小分子藥物，並嚴格調節淋巴細胞的外滲，從而限制了化學療法和效應T細胞在GBM組織中的積累。BBB的調節或障礙的規避促進了一些腦腫瘤治療，這表明功能性BBB的存在對於準確評估GBM治療可能至關重要。在再利用FDA批准的抗癌藥物具有增強的BBB滲透的GBM治療越來越大的興趣也表明BBB的GBM療效的潛在作用。當前GBM治療發展的瓶頸表明了當前建模方法的侷限性，並支援開發更可靠的模型系統，以幫助闡明涉及不同亞型的途徑，並提供更多資訊豐富的臨床前藥物評估，以加速藥物開發過程。

GBM建模不僅需要概括動態的多組分TME，而且還需要大腦在GBM發病機理和治療反應中起關鍵作用的獨特的解剖和生化特徵。傳統的建模方式重建GBM重要方面的能力有限，例如相關的腫瘤-基質相互作用和TME異質性，或者由於缺乏BBB屏障和與腫瘤發展，藥物相關的大腦其他特徵而無法可靠地評估新療法滲透性和治療效果。患者來源的異種移植物（PDX）保留了供體腫瘤的許多轉錄組和基因組特徵，並提供了有助於細胞生長的富含ECM的微環境。然而，產生PDX需要使用免疫缺陷的動物，這阻止了對相關免疫反應的研究，例如GBM細胞與腫瘤相關的小膠質細胞和巨噬細胞（TAM）之間的相互作用。TAM佔複發性GBM中約三分之一的腫瘤塊，並調節各種癌症活動，例如腫瘤細胞遷移，侵襲和耐藥性。PDX的開發也很耗時，並且通量相對較低，因此需要時間跨度，不適用於進展迅速的GBM等疾病。以可重現，高效和高通量的方式概述GBM的天然腫瘤-基質相互作用和GBM的細胞-ECM相互作用的體外模型可能是體內模型的更好替代方法。2D細胞培養是最常見且可訪問的體外建模方法，但它們缺乏適當的尺寸以及對GBM開發至關重要的細胞-ECM相互作用。2D培養條件還會誘導培養細胞的基因表達，細胞形態和細胞活性發生不可逆改變，從而降低了它們與原發腫瘤的相似性。Transwell系統已用於探索腫瘤發展，細胞依賴性以及BBB維持和分解中的細胞相互作用。然而，轉孔膜不能概括在轉孔培養BBB的緊密連線的動態變化，和細胞的固定孔徑經歷表型轉變，由於在2D培養條件和缺乏與ECM適當的相互作用。與其他體外培養方法相比，類器官是3D體外模型，具有仿生效果。GBM類器官更好地保持了原發性腫瘤的細胞異質性和基因表達，並且類器官中的腫瘤細胞與2D類相比表現出增強的低氧狀態和乾性。類器官制造協議已被開發，但類器官中的變異和細胞組織的由於自組裝過程限制其更廣泛的應用類器官內的有限的控制。在以可重現和可擴充套件的方式概括高度異質的GBM微環境或生理相關的BBB屏障特性方面，傳統的體外建模方法仍然受到限制。

先進的生物加工技術可以生成具有良好靈活性，可重複性和可伸縮性的定製3D組織模型，從而解決了其他建模方式的許多侷限性。可根據裝置製造後是否將細胞成分播種到構建體上或在製造過程中將其封裝在生物材料中來對生物製造技術進行分類。與細胞播種方法相比，細胞包囊方法可以更好地控制沉積細胞和分子的數量和位置，從而實現更好的重現性。封裝在水凝膠中的細胞會從各個方向遇到ECM提示，類似於它們的生理狀態，而接種細胞則主要從與水凝膠接觸的一側接收ECM提示。許多技術能夠製造具有高解析度和高通量的無細胞支架或裝置，例如電紡，熔融沉積建模和選擇性鐳射燒結等，但並不普遍用於細胞封裝目的。3D生物列印已經出現，以推進其在生物材料中以良好的生存能力封裝細胞並精確控制組織結構和基質特性的能力，從而推動了癌症和組織建模領域的發展。3D生物列印可建立可重現的個性化模型，使其特別適用於對腫瘤內和患者間異質性較高的疾病如GBM進行建模。生物列印技術的應用不僅限於活體組織，還包括無細胞支架，微流體裝置和可植入結構。動態的，微流體的BBB模型已經透過生物列印技術開發，該模型透過層流提供了對屏障功能至關重要的剪下應力。

在這裡，我們回顧了3D生物列印GBM和BBB模型的設計和製造方面的最新進展。我們首先提供GBM和BBB中微環境組成的詳細分析，重點是細胞和ECM的成分和性質。接下來，我們介紹用於實現感知模型的兩個重要工具：1）已用於生物應用的3D生物列印策略，並概述了其機理，優點，侷限性和應用，以及2）相關生物材料及其衍生物。然後，我們將回顧使用3D生物列印和生物材料構建GBM和BBB模型的當前研究，這些模型已證明與傳統模型相比具有生理相關的特性和改進的功能。最後，我們討論了GBM藥物開發的挑戰和未來前景。

GBM和BBB微環境

本節提供了天然組織的分層資訊：天然組織的組成部分，即細胞和ECM組成；基本組成部分的組裝和組織；以及組裝產生的微環境的生物物理或生化特性。

在GBM和BBB微環境中，細胞組成，功能以及與其他細胞的相互作用已得到廣泛研究和審查。在這裡，我們提供了一個簡單的介紹，介紹了基本的細胞成分和他們的角色。

GBM TME由異種細胞群體組成（圖 1）。GBM TME中的主要非新板間質細胞包括TAM，小膠質細胞，星形膠質細胞，神經元，間充質幹細胞（MSC）和血管周細胞。在GBM的壞死區域，多達30–50％的腫瘤塊由具有M2腫瘤表型的TAM組成。M2表型具有抗炎作用，可產生可抑制腫瘤生長的免疫抑制性TME。由於受損的血腦屏障和腦穩態的擾動，迴圈單核細胞衍生的巨噬細胞被募集到GBM部位，而小膠質細胞則是中樞神經系統駐留的免疫細胞，可響應腫瘤的線索而被啟用。這些免疫成分透過上調MMP-2和MMP-9等基質金屬蛋白酶（MMP）來促進腫瘤侵襲。星形膠質細胞可以透過多種通訊方式被腫瘤細胞募集並激活，包括細胞外囊泡和外排轉運蛋白。腫瘤相關的反應性星形膠質細胞促進CD133陽性膠質母細胞瘤幹細胞（GSC）的侵襲，並分泌抗炎細胞因子（如TGFβ）抑制抗腫瘤免疫反應，從而產生總體免疫抑制性GBM微環境。腫瘤細胞和神經元之間的突觸穀氨酸能促進通訊GBM生長和侵襲，並在GBM其他神經元作用已被歸因於自分泌訊號和旁分泌訊號。MSC也是GSC生態位中的重要基質成分，可促進間充質腫瘤轉錄狀態並透過白介素6和含miRNA-1587的外來體介導腫瘤增殖。

贅生性腫瘤細胞不是同質種群。單細胞組學研究證實了多種細胞狀態，包括類幹細胞GSC，它們可促進腫瘤的發生，治療耐藥性以及治療後的再生長。GBM細胞漫侵入到腦實質，排除完全手術切除。粘附分子，包括CD44和透明質酸介導的運動（RHAMM）受體，在GBM細胞的細胞表面表達，從而增強了粘附性和沿著富含透明質酸（HA）的腦ECM的遷移。[ 38 ]腫瘤細胞重塑區域性ECM，以透過分泌多種蛋白酶（例如MMP和纖溶酶原啟用物（PAs））協助入侵。GBM很少在CNS外轉移，提示腫瘤細胞已經適應了獨特的CNS微環境。

BBB的細胞成分包括腦微血管內皮細胞（BMEC），周細胞，星形膠質細胞和神經元，它們共同形成了CNS的功能性神經血管單位（圖 2）。微血管內層的BMEC是高度極化的內皮細胞，其特徵是連續緊密連線，粘附連線和有限的胞吞作用。連線蛋白複合物提供了阻止分子旁細胞擴散的物理屏障，緊密連線的高電阻阻止了帶電分子的進入。BBB特定的流入轉運蛋白（包括溶質載體蛋白）和外排轉運蛋白（包括ATP結合盒（ABC）家族成員）可以吸收營養到CNS中，並按照濃度梯度去除物質。外排轉運蛋白，例如ABCB1，ABCG2和與多藥耐藥相關的蛋白，從中樞神經系統中去除了治療劑，從而將其濃度降低至亞治療水平。周細胞是壁細胞包埋在微血管的基底膜。周細胞參與了血腦屏障的許多功能，調節內皮細胞緊密連線的形成和星形膠質細胞的尾足極化。較低的周細胞覆蓋率或缺乏周細胞可增加BBB的通透性。星形膠質細胞透過沿血管壁的末端腳壁與微血管相互作用。星形膠質細胞調節BBB擴散屏障特性，對於損傷後BBB修復至關重要。BMECs，周細胞和星形膠質細胞合成多數BBB-特定ECM蛋白。神經元透過神經元活動和腦源性神經營養因子（BDNF）等生長因子的釋放來調節BBB的通透性。在炎性條件下，大腦中的小膠質細胞向大腦血管遷移，並在血腦屏障完整性中起多種作用。儘管小膠質細胞的CCR5依賴性遷移最初可維持BBB完整性，但持續的炎症會導致星形膠質細胞吞噬末梢吞噬，從而損害BBB完整性。啟用的小膠質細胞分泌促炎分子，破壞了血腦屏障。雖然BBB在GBM中存在區域缺陷，尤其是在壞死的腫瘤核心附近，但BBB在與周圍腦實質接觸的腫瘤的增生和侵襲邊緣幾乎保持完整。

ECM調節許多大腦功能，BBB屏障特性以及GBM的起始，發展和侵襲。ECM為組織提供結構支援，與細胞和其他ECM元件發生物理相互作用，並在透過整聯蛋白和細胞表面受體結合後轉導訊號。大腦ECM約佔大腦總體積的17–20％，且主要由HA，蛋白聚糖（例如lectican家族）和糖蛋白（例如腱糖蛋白，酸性分泌蛋白和富含半胱氨酸）組成（SPARC）和血小板反應蛋白-1（TSP-1））。腦實質ECM成分存在於GBM基質中，但具有不同的表達模式。由於GBM中活躍的血管生成，GBM基質中的其他ECM成分包括玻連蛋白，骨橋蛋白和血管ECM成分。BBB的血管基底膜（BM）顯示出與腦實質或腫瘤基質完全不同的ECM成分。BBB ECM缺乏HA，主要由IV型膠原蛋白，層粘連蛋白，尼古丁（也包括entactin），perlecan，纖連蛋白和玻連蛋白組成。腦實質，GBM（表 1）和BBB（表 2）中的主要ECM成分），以其結構特性，與其他ECM成分或細胞表面受體的串擾，GBM基質中的表達模式以及調節大腦活動，GBM程序或BBB特性的主要功能展示。在許多中樞神經系統疾病中，ECM的數量或組成都會發生變化，但是特定的相互作用以及它們在分子水平上如何調節大腦微環境仍然是一個積極研究的領域。機械特性（例如組織的硬度）與ECM的組成和組織有關。構建3D模型將在更現實的環境中增進我們對ECM的理解，從而能夠識別驅動腫瘤轉化的特定相互作用基礎的新機制，因為可以在體外精確控制和隔離變數。

HA是一種不帶蛋白質核心的帶負電荷的糖胺聚糖（GAG），是大腦中最豐富的ECM成分。及其負電荷吸引陽離子和導致的水滲透湧入，其中，除了其親水性，導致高的保水能力。腦實質中的高HA水平以及I型膠原蛋白等纖維狀蛋白的缺乏，使大腦成為具有顯著可塑性的非常柔軟的器官。正常的腦實質具有0.1-1 kPa左右的彈性模量。在健康的腦，HA通常是在其高分子量形式存在，範圍從1000至8000千道爾頓。HA非共價結合其他ECM元件，包括lectican家族蛋白聚糖。蛋白聚糖由具有不同GAG側鏈的核心蛋白組成。排球菌是硫痠軟骨素蛋白聚糖（CSPG）的一個家族，其中包括versicans，aggrecans，neurocans和brevican。其他中樞神經系統CSPG包括磷醯胺和神經膠質抗原2。神經罐和短尾vic的表達主要限於中樞神經系統，而凡蟲和聚集蛋白聚糖則在人體其他部位更普遍地表達。Versican有幾種同工型；V2 versican亞型是健康成人大腦中主要的CSPG。Lecticans被認為是CNS ECM的組織者，因為它們可以與HA和Tenascin-R（TN-R）形成三元複合物，也就是CNS的神經周圍神經網路。Tenascin-C（TN-C）和TN-R是CNS中發現的兩種腱糖蛋白，分別由少突膠質細胞和星形膠質細胞產生。肌腱蛋白屬於基質細胞蛋白（MCP）家族，它們是非結構性ECM蛋白，能夠透過結合細胞表面受體和結構性ECM成分來調節細胞功能和細胞-ECM相互作用。中樞神經系統中另外兩個重要的基質細胞蛋白是SPARC和TSP-1。TSP-1與內皮細胞表面的CD36結合以抑制血管生成。

GBM的獨特ECM（主要由HA組成）有助於GBS廣泛侵入CNS，並限制了CNS外部極少的轉移擴散。HA含量相關因素與GBM惡性腫瘤。在GBM基質中發現高和低分子量HA水平升高，而低分子量HA與血管生成，腫瘤進展和遷移有關。HA受體，CD44和RHAMM以及腫瘤細胞表面的整聯蛋白促進細胞粘附至ECM並沿ECM遷移。腫瘤細胞與ECM的結合調節細胞運動性和蛋白酶產生，促進區域性ECM的重塑。低分子量HA和HA片段透過在巨噬細胞上透過Toll樣受體（TLR）（例如TLR4）傳遞訊號並誘導M2樣表型來參與免疫調節。GBM基質中許多蛋白聚糖的表達模式發生了變化。短尾蟎，也稱為富含腦的透明質酸結合蛋白，在GBM基質中升高，並參與GBM的生長和發展。V2 versican亞型在GBM基質中被下調，而V0 / V1亞型則與轉化生長因子β2（TGF-β2）相互作用以促進腫瘤進展。GBM基質內細胞周圍ECM中TN-C和SPARC的上調水平表明在血管生成中可能發揮作用。腫瘤細胞過度表達的TN-C也參與TAM啟用，並與GBM硬度相關。TN-R在高級別神經膠質瘤中的表達減少，但其作用尚不清楚。已知具有抗血管生成作用的TSP-1在GBM基質中被下調，與GBM TME中的超血管形成相一致。骨橋蛋白是一種基質細胞磷酸糖蛋白，能夠透過與CD44和整聯蛋白相互作用來促進腫瘤進展和轉移。在GBM微環境中骨橋蛋白的過表達誘導TAM中的M2表型，維持GSC的乾性，誘導血管生成，並增強腫瘤細胞遷移。纖連蛋白和玻連蛋白，其是BM的部件，也被過表達在GBM，報告給調節腫瘤細胞粘附力，內聚力，和侵襲，並激活的小膠質細胞。總體而言，ECM組成和表達水平的變化會隨著GBM的生長和浸潤而產生積極的反饋，從而導致腫瘤快速進展和不良預後。

GBM患者的腫瘤基質，浸潤性邊緣和非腫瘤性腦實質內ECM的不斷重塑導致微環境機械效能的可檢測變化。腫瘤基質的硬度範圍為11.4至26 kPa，GBM患者的非腫瘤腦區域的硬度為7.3±2.1 kPa，比健康大腦的硬度大得多。

主要的BBB ECM網路是由形成IV型膠原和層粘連蛋白的非原纖維網路形成的，並由尼古丁和蛋白聚糖穩定。BM通常採用厚度為50–100 nm的有組織的ECM薄板形式。膠原蛋白IV是血管BM的主要結構元素，具有由三條α鏈組成的三聚體結構，為BM提供結構支撐並保持BBB的完整性。層粘連蛋白是由α，β和γ鏈組成的三聚體蛋白。BMEC，周細胞和星形膠質細胞合成不同的層粘連蛋白同工型，導致層粘連蛋白同工型在包埋的周細胞兩側的血管BM中差異分佈。內皮細胞的BM富含BMEC和周細胞合成的層粘連蛋白411和層粘連蛋白511，而實質細胞側的ECM富含星形膠質細胞主要合成的層粘連蛋白211。內皮層粘連蛋白的整體敲除會誘導胚胎致死，而α2或β1亞基的缺乏會導致血腦屏障破壞和通透性增加。BMEC和周細胞合成的層粘連蛋白同工型不能補償層粘連蛋白211的損失，這可以解釋為什麼星形細胞層粘連蛋白不足時會發生嚴重的BBB分解。另外，整聯蛋白結合層粘連蛋白並調節緊密連線形成和BBB的滲透性。Perlecan是一種大型硫酸乙醯肝素蛋白聚糖（HSPG），可與包括Edogen在內的許多ECM蛋白結合，如果缺乏則可誘導胚胎致死性。Nidogen和perlecan在BBB完整性中的確切作用仍在研究中。纖連蛋白和玻連蛋白的水平與受損的血腦屏障和小膠質細胞活化有關，但尚不清楚它們的其他功能作用。

3D生物列印是一種增材製造技術，能夠根據計算機輔助設計（CAD）模型製造使用者定義的3D物件。可以從臨床影象（例如磁共振成像（MRI）掃描或計算機斷層掃描（CT）掃描）重建CAD模型，或者使用CAD軟體進行設計，以針對特定應用提供特定的幾何形狀。3D模型被分成一系列具有預定層厚度的2D橫截面切片，由生物印表機實施。3D生物列印過程可在所有三個維度上生成定義明確的結構，其高解析度，可重複性，靈活性和可定製性使其成為廣泛的生物學應用的有力工具。為了成功地對生物樣品進行建模，生物列印模型的仿生術需要使用效能匹配的生物材料，並結合相關的細胞型別和其他分子。主要的生物列印方法包括基於噴墨的，基於擠出的和光輔助生物列印過程的優點，限制和重要的生物列印方法的特徵總結於表4。無論採用哪種生物列印方法和生物材料，都可以成功構建細胞封裝的組織和疾病模型，用於篩選或遞送藥物的生物平臺以及無細胞支架。

基於噴墨的生物列印透過從噴嘴沉積體積受控的生物墨水液滴來形成3D結構。噴墨生物列印使用熱，壓電或靜電機制將液滴沉積到接收基材上（圖 3a）。在熱噴墨生物列印中，區域性加熱產生的氣泡從噴嘴噴出液滴。即時加熱基本上不會影響細胞活力。壓電和靜電方法分別利用從壓電致動器產生的壓力或壓力板的偏轉來噴射液滴。噴墨生物列印可提供簡單，低成本，快速列印速度和高解析度，而不會犧牲細胞活力。然而，對於該印刷方式，細胞密度需要保持在1百萬細胞mL -1以下，以減輕剪下應力，該剪下應力可能降低分配期間的細胞生存力。對於這種列印方法，在目標解析度，材料粘度，噴嘴尺寸和分配速度之間取得平衡至關重要。使用較小直徑的噴嘴可以產生更好的解析度，但是如果材料粘度不合適，則還會增加堵塞的可能性。低於12 mPa s的低粘度生物材料與噴墨列印相容。使用噴墨生物列印，已證明了廣泛的生物學應用，包括癌症模型，幹細胞研究，組織工程，單細胞研究，細胞陣列模式，和分子的控釋。噴墨生物列印還可以透過包含多個噴嘴來實現高產量，這使其成為篩選應用程式的理想選擇。

基於擠出的生物列印依賴於材料細絲透過噴嘴的連續沉積。與噴墨生物列印相比，連續過程使它能夠生成整體介面更好的結構。基於擠壓的生物列印的兩種主要分配機制是基於氣動的和基於機械的。後者包括活塞驅動和螺桿驅動方法（圖 3b）。在列印過程中，將載物臺或充滿生物墨水的分配噴嘴電動化，以逐層方式建立3D結構。氣動分配透過壓力變化直接控制，使其高度靈活；同時，壓力變化的延遲會降低其在沉積生物墨水空間控制中的精度。由於對物料流具有實時影響，因此機械分配方法通常在空間控制方面更好，而螺桿驅動系統特別適用於高粘性物料。擠出生物列印的多功能性使其可與多種生物材料相容，粘度範圍為30至6×10 7mPa·s。這種印刷方式還允許以相對高的密度以橢球形的形式封裝細胞。儘管在噴嘴內會發生的是，剪下應力，基於擠出的生物列印方法允許在印刷構建體具有較高細胞活力。基於擠壓的生物列印的解析度受到一些因素的限制，包括噴嘴直徑，膠凝動力學以及生物墨水的性質和組成。儘管脫細胞支架可以實現5 µm的高解析度，但細胞包封的樣品的解析度通常受到損害，通常超過100 µm，作為擴大規模潛力和高封裝能力的折衷方案。然而，基於擠出的生物列印是用於組織工程應用的最廣泛使用的生物列印策略，因為它產生具有生理學相關尺寸，機械效能，和細胞密度的樣品的能力。

光輔助生物列印使用光子能量來誘導生物墨水的光聚合，從而形成3D結構。光輔助策略在所有三個維度上都具有高解析度和對體系結構的精確控制。如果沒有在噴墨或擠出生物列印中發生的高剪下壓力，則使用光輔助生物列印方法，即使對於包括幹細胞在內的敏感細胞型別，也可以實現更高的細胞活力。可以根據製造過程對光輔助生物列印進行分類：基於掃描和基於投影。基於掃描的策略通常需要沿所有三個軸連續移動。首先，透過掃描生物墨水內或供體膜上的鐳射束，在一層上形成2D特徵。鐳射束然後沿著第三軸移動，通常是z軸，以建立3D結構。基於投影的生物列印一次聚合整個層。一個平面上的特徵由圖案光的單個投影形成，因此在列印過程中通常僅需要沿著第三軸移動電機。因此，與基於掃描的策略相比，基於投影的策略通常可提供更高的吞吐量和更快的列印速度。

在生物應用中常用的光輔助方法包括：

1）基於掃描的策略，例如基於鐳射輔助的生物列印（LAB）和基於雙光子聚合（TPP）的生物列印；

2）基於投影的策略，主要是基於數字光處理（DLP）的生物列印。

鐳射輔助生物印表機由脈衝鐳射源，接收基板和碳帶組成，碳帶由生物墨水層和通常由金或鈦製成的金屬鐳射吸收層組成（圖 3c）。在印刷過程中，鐳射脈衝在供體層上引起蒸氣氣泡，進而將生物墨水的液滴平行於色帶噴射到接收基板上。具有高細胞密度的微米級結構已被印刷，並且多種材料都與該策略相容。TPP是基於鐳射的直接寫入策略，它使用超快鐳射束（例如飛秒脈衝）來逐層跟蹤和聚合3D結構的橫截面特徵。TPP透過同時吸收近紅外飛秒脈衝鐳射中的兩個光子來聚合生物墨水（圖 3d）。TPP的解析度不受光源衍射極限的限制，因此可以實現亞微米級的功能。使用TPP的聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA）印刷了1 µm或更小的精細特徵。相對較高的解析度使其適合生物材料的精細構圖和單細胞研究，但需要權衡較慢的生物列印速度和可擴充套件性的限制。

DLP生物列印是一種基於投影的快速立體光刻，可以在幾秒鐘到幾分鐘內製造毫米或釐米級的構造。DLP印表機通常配備數字微鏡裝置（DMD）晶片，電動載物臺或生物列印探針，一組光路以及計算機，以將載物臺或探針的移動同步到相應的圖案（圖 3e））。DMD晶片包含數百萬個微鏡，可以獨立開啟或關閉這些微鏡，以顯示具有微米級功能的使用者定義圖案。光可固化生物墨水僅在DMD晶片投射光的位置聚合，從而可以實現解析度為2 µm的高畫質晰度架構。透過這種生物印刷策略已經生產出整合多種細胞型別和多種ECM材料的功能性組織構建體。實現了高細胞活力，包括幹細胞衍生的細胞。DLP生物列印允許對材料效能，如彈性模量和生化線索，這是生物學研究的重要方面的量的精確控制。許多生物材料已用於DLP生物列印，包括HA，明膠，脫細胞的ECM，絲素蛋白，聚乙二醇（PEG），PEGDA和聚氨酯（PU），而有些則需要進行修飾以獲得光敏性。DLP的廣泛的生物學應用包括控制生長因子的釋放，神經再生，高通量藥物測試，和組織和疾病建模。甲DLP基於體積3D生物列印策略，命名為計算機軸向光刻（CAL），使整個三維結構的製造透過與同步圖案的突起bioinks的一個完整旋轉（圖 3F）。該策略依賴於CT重建的反投影演算法。與先前使用場干擾的嘗試相比，此實現可提高几何靈活性，從而使其能夠列印複雜的非對稱3D結構。為了避免使用支撐材料，使用了粘度高達90 000 mPa s的材料。這種策略具有許多獨特的優勢，例如能夠在現有物件周圍進行列印，並且具有可伸縮性，從而可以在一分鐘內製造出釐米級的結構。

仿生3D模型要求具有良好生物相容性和組織特異性的生物材料，包括適當的生物物理/生化特性和降解動力學。生物材料形成促進細胞粘附，增殖和遷移的結構網路，並提供特定的時空線索來調節細胞行為。在這裡，我們按照與大腦微環境的相關性以及3D建模和3D生物列印的適用性的順序討論生物材料（表 3）。生物材料的兩個主要類別包括：1）天然材料，它們是天然組織ECM的組成部分，以及2）具有良好生物相容性的合成材料。天然材料與生俱來具有生物相容性和生物活性，具有生化和生物物理特徵，可導致出色的仿生效果，並且可以透過自然降解機制進行改造或清除。替代地，合成材料具有確定的化學結構和可調性質，但是缺乏先天的生物活性或生理降解機制。但是，可以對合成材料進行修改，以摻入粘附肽或可裂解的接頭，以模仿天然ECM的功能或結構特性。3D建模通常結合多種生物材料來利用每個單獨元件的集體特性。

為了清楚起見，我們將適用於生物印刷過程的生物材料稱為生物墨水。開發具有良好可印刷性和仿生性的生物墨水對於3D生物列印應用至關重要。生物油墨的可印刷性包括各個方面，例如粘度，熱敏性和光敏性，這取決於特定的生物印刷方式。另外，流變性質，交聯機理和動力學以及印後機械性質，例如彈性模量和溶脹率，是生物油墨的重要引數。為了增強仿生效果，生物墨水通常與細胞，生長因子，細胞因子和其他分子結合在一起，以適應特定的生物學應用。

天然生物材料及其衍生物

HA是交替組成的帶負電荷的，線性多糖d -glucuronic酸和N-乙醯基- d -葡糖胺，在神經元和神經膠質細胞的細胞質膜合成。由於HA在大腦和GBM基質中占主導地位，並且透過與細胞和其他ECM成分的相互作用在調節各種生理和病理過程中起著至關重要的作用，因此基於HA的水凝膠是模擬大腦組織和骨骼的最相關基質材料。腦腫瘤。HA水凝膠具有奈米孔結構和一定範圍的彈性模量，可重現大腦和GBM基質。HA已與多種生物材料結合，包括I型膠原，甲基丙烯酸明膠（GelMA），殼聚糖，層粘連蛋白，纖維蛋白，和PEG製造3D GBM模型。HA顯示出大小依賴性的調節行為，因此在設計特定模型時應考慮HA的分子量範圍。超過1000 kDa的HA適用於對健康的大腦組織進行建模，而在GBM基質中觀察到分子量較低的HA會影響GBM的進展和遷移。透過固定一系列HA–GelMA水凝膠的多孔彈性，與較高分子量的HA（500 kDa）相比，較低分子量的HA（10和60 kDa）導致更高的侵襲性。HA的分子量不影響HA–GelMA水凝膠的彈性模量。所有組的測量值均在3 kPa左右。由HA，層粘連蛋白和纖維蛋白製成的支架支援人類神經前體細胞（NPC）的生長和血管形成。

先前已審查了化學修飾以生成適合3D建模或3D生物列印的HA衍生物。修飾通常靶向上的羧酸基團d -glucuronic酸部分，在N-乙醯基N-乙醯基d -葡糖胺部分，和在兩個部分的羥基。HA衍生物透過自由基聚合形成水凝膠。例如，在N-乙醯基d的C-6羥基上用甲基丙烯酸縮水甘油酯或甲基丙烯酸酐官能化的HA葡糖胺可形成甲基丙烯酸縮水甘油酯HA（GMHA）或甲基丙烯酸HA（MeHA）可在光引發劑（例如苯基-2-4,6,3-三甲基苯甲醯基次膦酸鋰（LAP））存在下光聚合形成水凝膠。GMHA和MeHA由於具有快速的光聚合能力，因此是適合光輔助生物印刷的生物墨水。肝組織和GBM模型已使用基於GMHA的水凝膠混合物進行生物列印的MeHA也被官能化與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽，以促進細胞粘附到3D矩陣。形成基於HA的水凝膠的另一種方法是透過加成和縮合反應。HA硫醇衍生物在沒有引發劑的情況下透過在空氣中形成二硫鍵自發交聯，使其成為用於擠出或噴墨生物列印的良好生物墨水候選物。醛，二醯肼和滷乙酸酯改性的HA透過加成和縮合反應形成生物相容的水凝膠。

明膠是膠原蛋白的部分水解產物。明膠及其衍生物因其固有的生物活性特徵（包括整合素結合的RGD序列和MMP消化位點）而被廣泛用於3D組織建模。與單獨培養的腫瘤細胞或PVN細胞相比，在3D明膠基質中共培養血管周圍小生境（PVN）細胞和GBM細胞的水平更高，血管生成和ECM重塑。由於良好的流變性和熱響應特性，基於明膠的材料是用於基於擠壓的生物印刷中的流行生物油墨。明膠水凝膠已經實現了肝細胞的封裝，並且經過3D列印的組織在培養兩個月後仍保持活力和功能。明膠還可以與合成材料（例如PU）結合使用，從而在更長的生物列印視窗和更高的解析度方面提高其可印刷性。明膠-PU基質使MSC具有較高的生存能力和增殖能力。GelMA是明膠的多用途衍生物，在3D生物列印中也很流行。GelMA是透過用甲基丙烯醯胺和甲基丙烯酸酯側基修飾賴氨酸和羥基而開發的，從而使預聚物GelMA生物墨水在紫外光照射下在光引發劑的存在下可光聚合。GelMA保留了明膠的生物學特性，並使3D矩陣具有可調的機械效能。GelMA可以用作基礎基質材料，以促進腦相關研究中其他功能性ECM（例如HA）的研究。透過將基於明膠的基質與不同量的可溶性或固定化HA混合，研究了HA的生化線索對腫瘤生長的影響。當HA濃度在0.3％至0.5％之間時，血管生成標記物和缺氧標記物的表達顯示出雙相峰。基於GelMA的水凝膠可產生HA，交聯密度和GBM細胞密度的梯度。在空間上分級的基質揭示腫瘤細胞增殖和促血管生成的表達與區域性交聯密度和腫瘤細胞密度相關，而區域性MMP2表達與細胞密度成反相關。GelMA也已與PEGDA結合使用以產生用於治療心肌梗塞的心臟貼劑。

膠原蛋白是大多數人體組織中普遍存在的ECM成分。儘管大腦實際上不存在I型纖維狀膠原，但血管基底膜富含IV型膠原和一些V型膠原。因此，源自膠原的生物材料適合用於BBB的建模。但是，由於對GBM的膠凝機理研究充分，各種GBM研究都利用了膠原蛋白生物材料，包括基於pH和基於溫度，豐富的細胞結合位點以及可調節的機械效能，以滿足組織的特定要求。GBM細胞在3D矩陣中按膠原型別採用不同的形態：IV型為圓形，I / III型為紡錘狀。膠原蛋白通常與其他生物材料結合使用，包括HA，瓊脂糖和合成材料，以進行組織建模。在具有HA的混合基質中，只有IV型膠原而不是III型膠原支援GBM細胞增殖。純膠原蛋白溶液具有相對較慢的膠凝過程和低粘度增加。預聚物溶液中膠原蛋白的濃度或包括核黃素的含量可提高生物列印的準確性包含核黃素可增加膠原蛋白生物墨水的儲能模量，改善可印刷性。膠原蛋白生物墨水的膠凝通常是熱控制或pH驅動的，而膠原蛋白生物列印已用於組織工程應用，包括心臟再生和肝臟建模的水凝膠的彈性模量可在0.9和3.6千帕，這是適用於腦組織之間定製。

dECM是透過去除組織的所有細胞成分，同時保留大多陣列織特異性和患者/宿主特異性的ECM結構和成分，並保留有利於細胞生長的天然ECM線索而獲得的。對GBM患者腦組織衍生的dECM的分析表明，加工後GAG，HA，IV型膠原，層粘連蛋白和纖連蛋白沒有受到明顯干擾，因此適合作為體外建模生物材料。患者腦部dECM已與膠原蛋白混合在一起，以透過基於擠壓的生物列印實現更好的凝膠化。與膠原蛋白對照中的細胞相比，在基於dECM的患者基質中，已擴散的單細胞具有異質和圓形的形態。此外，基於dECM的基質中的GBM細胞表達增加的基質重塑蛋白MMP9和HA相關基因，包括Hyal1，Hyal2，HAS2和CD44。儘管基於dECM的水凝膠的緩慢凝膠動力學常常需要將dECM生物墨水與其他生物材料整合以改善可印刷性，但最近的研究僅誘導了dECM生物墨水的熱凝膠化。基於dECM的生物墨水已開發用於各種組織，例如軟骨，心臟，脂肪，肝臟和腫瘤，並在基於擠出和基於DLP的生物印表機上顯示出良好的可印刷性。然而，DECM通常是從一個個體的組織衍生的並含有多種天然蛋白質和多糖的，所以變化是不可避免的，在特定的變數控制是有挑戰性的。儘管存在侷限性，但dECM具有針對個別患者進行GBM建模的潛力，仍然是精密醫學應用中生物材料的絕佳選擇。

基質膠是可熱固化的ECM成分的混合物，其成分來自鼠類Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤，由約60％層粘連蛋白，30％IV型膠原蛋白，8％膠原蛋白，其他生長因子和蛋白聚糖組成。它與血管ECM成分的相似性使其特別適合BBB建模。因此，Matrigel被廣泛用於體外血管形成和相關研究。GBM類器官也已在Matrigel中開發，類器官中的細胞顯示出低氧梯度以及莖和增殖的異質性。但是，儘管許多研究表明GBM細胞具有良好的生存能力和在基質中的增殖，但Matrigel中的大多數蛋白質在大腦中的含量很少（BBB除外）或GBM，使其成為GBM建模的次佳選擇。Matrigel的侷限性包括其動物起源，降低實驗可重複性的批次變化以及對形成的3D基質的物理化學性質的有限控制。由於其相對較差的機械效能和缺乏光敏性，Matrigel的可印刷性也受到限制，因此它經常與其他生物材料（例如瓊脂糖，藻酸鹽和明膠）結合使用3D生物列印技術來製造支架或組織模型。

纖維蛋白是透過纖維蛋白原和凝血酶的交聯形成的。纖維蛋白水凝膠的機械效能主要取決於纖維蛋白原的濃度，而在較小程度上取決於凝血酶。血纖蛋白基質可實現0.058至4 kPa的硬度，這是腦部應用的相關範圍。GBM球蛋白和纖維蛋白基質中的內皮細胞的共培養模型已用於測試抗血管生成化合物。與沒有VEGF或VEGF膠原蛋白水凝膠的纖維蛋白基質相比，負載有血管內皮生長因子（VEGF）的纖維蛋白水凝膠支援神經幹細胞的生長和遷移，證明了纖維蛋白基質嵌入生長因子以延長培養時間的有益特性。同樣，在纖維蛋白基質中培養的具有細胞毒性的人MSCs觀察到改善的細胞增殖和持久的永續性，從而使基於MSC的GBM治療能夠抑制術後復發。基於纖維蛋白的生物墨水在基於擠壓的生物列印中很流行。纖維蛋白生物墨水已與明膠，藻酸鹽或HA混合以改善其機械和生化特性，並生成了各種組織模型，包括GBM模型，心臟組織和牙本質-牙髓複合體。

對於CNS研究，還探索了並非大腦天然存在但具有良好生物相容性和可印刷性的其他天然生物材料。絲素蛋白（SF）已用於神經網路的形成，而結冷膠已用於多層神經迴路的形成的SF水凝膠的硬度的範圍和GG水凝膠適合於建模GBM基質。人類GBM細胞系在兩種型別的SF水凝膠中表現出不同的反應-增強的活力和無規捲曲型細胞的增殖以及誘導的結晶型細胞凋亡。具有可調機械效能和印刷後降解速率的SF水凝膠也可以適應不同的生物印刷應用。天然腫瘤基質或BBB中存在的其他非網路形成的ECM成分可與上述水凝膠形成的生物材料一起摻入3D基質中，以在未來的研究中改善材料的仿生性。