撰文 | Qi

責編 | 兮

G蛋白偶聯受體（G-protein-coupled receptors, GPCRs）作為近一半藥物的靶點，與arrestin的結合可以控制細胞訊號傳導的多重方面。Arrestin可以透過阻斷G蛋白偶聯來降低GPCRs的敏感性，可以促進GPCRs內吞改變G蛋白介導訊號的作用，且arrestin可以透過與一組廣泛的效應蛋白結合，包括各種激酶（例如ERK1/2、Akt、Raf-1、JNK和Src）、E3泛素連線酶（例如Mdm2），去氨基化蛋白酶（如USP33）等來控制細胞內多種訊號通路【1,2】。有趣的是，某些GPCRs配體可以選擇性地促進或抑制某些arrestin功能，這導致人們對設計GPCRs靶向藥物產生極大興趣，即可透過選擇G蛋白和arrestin偶聯或在arrestin介導的訊號中進行選擇，以刺激特定的GPCR介導的訊號而不產生有害副作用。

過去十年的研究證據支援“條形碼（barcode）”假說，即不同組合的GPCR殘基磷酸化會導致不同的arrestin介導的訊號效應【3】。有研究報道，與不同磷酸化的GPCRs結合的arrestin通常會採用不同的構象，並且某些磷酸化模式影響GPCRs對arrestin的親和力，由此產生具有不同穩定性的訊號複合物。然而截至目前，仍有以下疑問尚待解決：（1）不同“條形碼”對arrestin的分子效應以及產生這些效應的機制如何？（2）arrestin所採用的實際構象，以及導致這些構象的磷酸化模式如何？（3）磷酸化誘導的arrestin構象的變化是否與arrestin結合的變化相對應？（4）這些影響在多大程度上取決於附著的磷酸鹽的數量或磷酸化的位點？

近日，來自美國斯坦福大學的Ron O. Dror課題組在Cell雜誌上發表了一篇題為“How GPCR Phosphorylation Patterns Orchestrate Arrestin-Mediated Signaling”的文章，在這項研究中，作者採用兩種互補技術即分子動力學模擬和定點光譜法確定GPCRs磷酸化如何影響arrestin行為，揭示磷酸化模式對arrestin結合和構象的影響。這一工作為“條形碼”假說的結構基礎作出解釋，並對功能選擇性GPCRs靶向藥物的設計具有重要意義。

為了確定GPCR磷酸化如何影響arrestin的結合和構象，作者進行β-arrestin 1與包含8個磷酸化殘基V2加壓素受體（V2R）C尾結合的全原子分子動力學模擬。在這個過程中，作者觀察到具有相同數量磷酸鹽的磷酸肽能夠不同程度地啟用arrestin，且磷酸肽緊密結合β-arrestin 1的能力取決於磷酸化殘基的位置而非其數量。例如，在僅S350磷酸化或僅T360磷酸化時，在S357處新增磷酸鹽可顯著降低arrestin活性；類似地，在僅S350磷酸化時，在S362處新增磷酸鹽可顯著降低結合穩定性。為了確定每個磷酸鹽對arrestin結合和啟用的貢獻程度，作者擬合加性迴歸模型，其中每個殘基對活化和結合都有獨立的貢獻。舉例而言，pT360既有助於活化，又有助於結合，而pS350和pT359雖然有助於活化，但對結合卻幾乎沒有貢獻等。值得注意的是，磷酸化特定殘基的效果通常取決於哪些其他殘基被磷酸化。如果將S362處的磷酸鹽新增到僅具有S350磷酸化的肽段則不利於arrestin的啟用，而將相同的磷酸鹽新增到同時具有S350和S363磷酸化的肽段上則傾向於arrestin的啟用。這種機制可以解釋為什麼GPCR有時需要丟掉磷酸鹽來有效地與arrestin結合，或者為什麼多個G蛋白受體激酶（G protein receptor kinases, GRK）存在有時會降低arrestin的訊號傳導。

圖1，不同位點的磷酸化可以刺激或抑制arrestin的啟用和結合

模擬實驗也解釋了不同的磷酸化位點如何發揮不同作用。磷酸鹽主要透過調節門環構象來刺激或抑制arrestin的整體啟用，門環從arrestin C端結構域延伸到N結構域的溝槽中，與結合的GPCR C尾接觸。當一種特定的磷酸化模式不能適當地平衡arrestin結構域中央溝的靜電勢時，磷酸鹽對arrestin的啟用和結合就會產生負性調節，例如最有助於結合的磷酸鹽，pT360和pS363位於至少含有兩個帶正電荷殘基的口袋中，平衡磷酸鹽的雙重負電荷，相比之下，抑制結合的pS362不能與鹼性殘基配對以完全中和其在晶體構象中的電荷。此外，作者在模擬中發現，S350位點的磷酸化對域間隙和指環的構象存在顯著影響，但對門環的影響卻很小；pT347支援指環的活性構象，卻不支援arrestin其餘結構域的活性構象等。除此之外，作者還透過定點光譜法得到與上述模擬一致的結果，即不同的arrestin結構域可以相互獨立地改變構象，GPCR磷酸化可以影響某些arrestin結構的構象而不影響其他結構域。這些結果提示可以透過特定的磷酸化模式引起arrestin的特定構象改變從而只暴露某些下游訊號蛋白結合位點，從而影響特定下游效應。

總的來說，這項工作透過模擬研究和實驗測試證實一種蛋白質在其結合伴侶的磷酸化狀態發生變化時所能經歷的令人驚訝的豐富的構象變化，這提示許多其他蛋白質家族也有類似的可能性，同時也顯示出靶向GPCR的藥物可以透過偏向特定的磷酸化模式來選擇性誘導所需的細胞效應。當然，具體的arrestin構象與特定訊號通路之間的關係仍是值得深入探究的課題。

原文連結https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.014

製版人：琪醬

參考文獻

1, Gurevich,V.V., and Gurevich, E.V. (2019). Plethora of functions packed into 45 kDaarrestins: biological implications and possible therapeutic strategies.Cell.Mol. Life Sci. 76, 4413–4421.

2, Peterson,Y.K., and Luttrell, L.M. (2017). The Diverse Roles of Arrestin Scaffolds in GProtein-Coupled Receptor Signaling. Pharmacol. Rev. 69, 256–297.

3, Tobin, A.B.(2008). G-protein-coupled receptor phosphorylation: where, when and by whom.Br. J. Pharmacol. 153 (Suppl 1 ), S167–S176.