然而，由於基因組不同位置有著不盡相同的上下文環境，導致這些工具在一些位點的編輯活性不佳，無法實現預期目的，因此往往需要進一步的分子工程化改造來提升工具效能。CRISPR-Cas12a系統以其自主加工嚮導RNA (gRNA) 序列，識別基因組中富含A/T DNA鹼基的區域, 產生粘性DNA切割末端等諸多不同於Cas9系統的新特性，受到領域內的青睞。其同源蛋白AsCas12a和LbCas12a已被用於包括人在內的哺乳動物細胞基因組編輯，但是要求在靶向位點上游有較為複雜的緊鄰序列 (PAM), 這限制了其靶向更多位點的能力；在其他已報道的Cas12a同源蛋白中，FnCas12a對PAM的要求更少，具備很大潛力來擴大Cas12a系統的識別範圍，但是在人細胞基因組中，FnCas12a在很多位點都沒有可檢測的編輯活性【1】。

因此，如何能夠在保證Cas12a編輯活性的同時又擴大其可靶向位點的範圍，成為研究Cas12a系統的熱點問題。

2020年12月21日，河北科技大學基因編輯研究中心武永強課題組和美國萊斯大學化學工程系博士研究生袁啟宸 (共同通訊) 合作在The CRISPR Journal 雜誌上發表了題為Improving FnCas12a genome editing by exonuclease fusion 的研究文章。透過對FnCas12a切割模式的分析，結合人類細胞內源DNA修復通路中非同源末端連線機制 (NHEJ)，提出將單鏈DNA外切酶與FnCas12a進行融合，以引導NHEJ機制對FnCas12a產生的DNA斷裂末端傾向性地進行易錯修復而非精準修復，從而提升了所靶向位點的隨機插入和刪除(Indel) 的效率，為應用CRISPR-FnCas12a在人類細胞中進行有效基因敲除 (knock-out)提供了新思路 (圖一), 並有望進一步用於開發治療人類遺傳疾病的策略，例如鐮刀型細胞貧血症（SCD）， 遺傳性I型酪氨酸血癥（HT-1），杜氏肌營養不良症(DMD)等一系列可透過基因敲除達到治療效果的疾病【2】。

在此前已報道的研究中，提高CRISPR-Cas12a基因敲除效率的策略通常集中於兩類：一是透過對Cas12a的蛋白質工程化改造來增強Cas12a的核酸酶活性， 二是透過最佳化gRNA序列來提高其二級結構的穩定性，以避免gRNA被內源蛋白降解而影響Cas12a的靶向功能。然而，基因敲除的決定性步驟——NHEJ通路很少被合理地利用到。當DNA雙鏈斷裂 (DSB) 產生後，NHEJ通路會盡快將斷裂的兩端重新連線在一起，而其修復結果很大程度與DSB斷口的形狀直接相關，在平末端情況下，NHEJ傾向於在連線過程中隨機引入Indel，最終得到出錯的序列，從而達到基因敲除的目的；而在兩個粘性末端完全互補配對的情況下，NHEJ通常會準確地修復斷口，而不會產生Indel【3】。因此，研究人員認為透過將FnCas12a的DNA切割末端由互補配對的粘性末端變成平末端，可以引導NEHJ通路更加偏向易錯修復，從而提高FnCas12a的基因敲除效率（圖一）。

圖一 | TEXT系統利用易錯NHEJ通路提升FnCas12a的knock-out效率。

為了驗證這個假設，研究人員選取了多種單鏈DNA核酸酶與FnCas12a融合，發現多種候選酶都對基因編輯效率有提高效果，其中來源於T5噬菌體的DNA外切酶融合到FnCas12a的N端提升效率最高，並將其命名為TEXT (Tethering EXonuclease T5 with FnCas12a) 系統，此係統可以將細胞NHEJ修復引導到易出錯的通路，使Indel效率明顯高於單獨使用FnCas12a的效率, 在FnCas12a 無檢測活性的位點，TEXT也顯著性地提升了Indel效率。TEXT 與FnCas12a、 LbCas12a和AsCas12a相比，在所有測試位點中編輯效率都是最高，並且在所測脫靶位點沒有表現出顯著的脫靶效應 (圖二)。文章最後也指出，目前尚不清楚T5外切酶是否會對細胞中自然發生的DNA損傷反應 (例如細胞內源產生的DNA雙鏈斷口) 具有一定的脫靶效應，因此在未來有待透過開發新的深度測序方法來監測外切酶在全基因組範圍的脫靶效應，相應地，系統的蛋白質工程或者時間空間高度可控的基因編輯方法都可用於進一步提升TEXT的安全效能。

值得注意的是，中科院邱金龍研究組今年稍早發表的文章中也利用相似的策略，將T5外切酶與Cas9或LbCas12a進行融合，在對水稻的基因編輯中也得到了Indel有所提升的結論【4】。兩項研究的不同點在於，在人細胞中所測試的Cas12a同源蛋白中，只有FnCas12a與T5外切酶的融合表現出明顯的Indel提升，而AsCas12a或LbCas12a與T5外切酶的融合均沒有顯著增加Indel效率。為了解釋所發現的不同點，研究人員根據Jennifer Doudna研究組在今年六月份發表的文章推測【5】，由於AsCas12a和LbCas12a不僅會產生粘性末端，還會降解沿非靶向ssDNA鏈的幾個鹼基，因此本身具備類似於TEXT系統的功能，其編輯效率在人細胞中有可能趨近於飽和狀態，限制了外切酶的效果。

圖二 | TEXT系統與FnCas12a, AsCas12a 和LbCas12a在不同位點的編輯活性比較

總的來說，TEXT系統提升了FnCas12a在人基因組中基因敲除 (knock-out) 的效率， 擴大了FnCas12a可以靶向的範圍，在NTTV型別PAM的人類基因組所測位點上，TEXT系統顯示出比FnCas12a、LbCas12a和AsCas12a更高的基因編輯效率。

原文連結：

https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2020.0073