穩定細胞系構建最常用的方法是採用慢病毒。那是否一定要採用慢病毒呢？答案是非必須的。採用質粒瞬轉也能夠構建穩定細胞系。下面就和細胞君一起熟悉質粒瞬轉構建穩定系：

方法應用前提：目的細胞的瞬轉效率?

細胞君曾多次轉染極易轉染的HEK293，細胞數量約2*10^6個，最終能夠存活的單克隆個數不到50，能夠穩定表達外源基因的就更少了。基於此，我們就瞭解到轉染效率越高，我們獲得穩定細胞系的機率就越大；轉染效率低的情況下如不足5%，細胞君建議同學們只能是嘗試不要浪費太多時間糾結。

有的同學會問既然瞬轉效率低，那我是否可以直接放大細胞量進行操作呢？理論是可行的，但要面臨更大的工作量和成本。且轉染效率太低，單克隆獲得量的差別就是數量級，放大細胞量恐難以實現。

Tip: 同學們可以透過摸索轉染試劑新增量、質粒新增量等條件轉染目的細胞熒光表達對照質粒預實驗得到最佳轉染效率條件。

構建穩定細胞系具體方法：相信同學們都知道大概如下流程，我們只聊聊單克隆篩選階段：

構建穩定細胞系流程：轉染——單克隆篩選——擴增，檢測——入庫

1、 各操作時間節點

單克隆篩選鋪板：轉染後24h。因我們轉染細胞密度較高，所以轉染後24h要儘快鋪板，防止細胞堆積狀態變差。

單克隆篩選藥篩：轉染後48h。該時間節點為瞬轉外源基因表達高峰，若細胞狀態差放緩至72h再藥篩。每3~4天，更換或補充含藥培養基。

單克隆篩選擴增：篩選2~3周。單克隆形成的時間一般為2~3周。

2、各操作變數

單克隆藥篩濃度：首輪藥篩1/4~1/2的梯度藥篩濃度。3~4天后，觀察存活的細胞數量，如只有極少量單個細胞存活，此時可依據細胞狀態更換為無藥物培養基或1/4的藥篩濃度以維持篩選壓力。否則繼續維持梯度的1/4~1/2藥篩濃度篩選直至只有極少量單個細胞存活。

Tip：我們的目的是讓整合的細胞能夠存活，非整合細胞被滅殺，所以一定要梯度給藥，只要有合適藥物濃度篩選下的單克隆存活即可。

藥篩濃度：細胞密度20%藥篩3~4天100%細胞死亡的藥物濃度。

單克隆鋪板細胞密度：低於10%。因為轉染細胞基量大，整合率低，需要將全部的細胞用於篩選。所以應控制篩選密度低於10%便於藥篩。如果密度高，則不能完全滅殺非整合細胞或難以獲得單克隆。

單克隆轉移，擴增：單克隆細胞個數最少大於50個方可轉移擴增，推薦轉移至96孔板，以期提高初始細胞密度讓細胞快速增殖。