撰文 | Qi

責編 | 兮

靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）是一種新興的有望克服傳統藥理學抑制方法侷限性的治療手段，透過使用小分子降解劑將E3泛素連線酶募集到原本不會被認作底物的目標蛋白（proteins of interest, POI）上，以“劫持”細胞降解機制【1,2】。截至目前，使用TPD策略已成功降解了來自不同蛋白質家族和結構類別的60多個POI。儘管將TPD作為一種新的藥理方法進行廣泛的探索，但仍然很難預測哪些蛋白質易處理，哪些可能對這種方法具有抵抗性。類似地，由於對結合的非線性依賴性，降解靶標譜通常與抑制劑選擇性譜有很大差異，因此建立TPD目標空間需要更大量的經驗資料集【3】。

近日，來自韓國科學技術學院的Taebo Simu團隊，以及來自美國丹娜-法伯癌症研究所的Nathanael S. Gray團隊和Eric S. Fischer團隊在Cell雜誌上合作發表了一篇題為Mapping the Degradable Kinome Provides a Resource for Expedited Degrader Development 的文章，在這項研究中，作者透過大規模化學探索靶向蛋白質降解的關鍵變數，建立了包含200多種不同的可降解激酶圖譜，將其作為公共資源提供於平臺（https://proteomics.fischerlab.org），併為未來開發的激酶降解劑提供了新的通用設計原理。

首先，作者開發了一個激酶靶向降解劑的大型文庫，篩選出212種降解的蛋白激酶相關靶標，較先前報道的57種激酶數量顯著增加（見下圖1）。在建立了易於處理的目標後，作者接下來著手評估化學和細胞變數對TPD功效和選擇性的貢獻，主要包括細胞靶標參與，三元複合物形成、靶蛋白丰度、泛素蛋白酶體系統（ubiquitin proteasome system, UPS）、細胞系變異、募集的E3連線酶影響以及化學變數（例如接頭長度等）。

圖1. 靶向蛋白降解劑的作用方式及本研究採用的實驗方法流程圖

人們普遍認為降解劑會使功效與靶標占有率脫鉤，作者透過使用KiNativ分析比較所有定量蛋白激酶的相對丰度變化和佔有率，結果顯示細胞靶標參與度與降解能力之間沒有相關性，提示靶標結合不是主要的驅動降解功效的因素。有研究提出，降解劑的一個重要因素在於靶標-連線酶蛋白-蛋白相互作用的互補性差異使其具有提高靶標選擇性的潛力【4】。為使化合物誘導的降解成功，三元複合物（連線酶-降解物-POI）的形成對於泛素轉移至POI是必不可少的。隨後，為了比較三元複合物的形成與靶蛋白在整個kinome中參與和降解之間的差異，作者在存在四種選擇的多激酶靶向降解劑的情況下，透過實驗評估了與CRBN形成複合物的激酶的廣度。有趣的是，作者觀察到許多激酶即使未形成可檢測的三元複合物也被降解，表明瞬時或低丰度複合物也可導致有效降解。

已有研究表明靶標表達水平或區域性濃度可能會影響靶蛋白降解性，作者想知道TPD效率對靶標蛋白表達水平的依賴性。為此，作者定量評估了三種正交細胞系MOLT-4，KELLY和HEK293T中蛋白質的相對錶達，並對這些細胞系中四種多激酶靶向降解劑進行分析，結果也同樣排除了靶蛋白表達水平作為細胞系之間降解差異關鍵驅動因素的情況。基於先前報道的不同的E3連線酶對泛素化特定蛋白的傾向差異，那麼改變募集的E3連線酶是否對可及靶蛋白範圍存在影響呢？作者發現一種CRBN募集的降解劑降解了70種不同激酶，而加入VHL後，額外鑑定出了16種降解的激酶，即相當於靶向激酶增加了23％。進一步的研究表明許多激酶存在連線酶偏好性，而這種偏好性在整個可降解激酶組中均成立。

事實證明連線子長度的變化會顯著改變降解劑的選擇性，為了系統評估連線子差異的重要性，作者合成了六個多靶標激酶降解劑並對其進行分析。資料顯示，激酶靶標的數量隨連線子長度的增加而降低，這是令人驚訝的結果，因為先前多次報道提出長接頭比短接頭能更有效地形成三元複合物並誘導降解。此外，在這一資料集中，一個激酶子集表現出較強的接頭偏好性，包括對特定分子的偏好，對端接頭的偏好或者對特定接頭連線區域的偏好。因此，在缺乏經驗資料或尚待開發的預測模型的情況下，可能需要透過廣泛地摸索以合成恰當的連線子。

在先前的研究中已經證明AAA + ATPase p97解摺疊酶活性對於從多蛋白複合物，染色質或膜結合複合物中提取標記為降解的蛋白質而言是必不可少的【5】，然而，尚不清楚是哪些因素決定泛素化蛋白質的降解是以p97依賴性還是p97依賴性方式發生。在這項研究的最後，作者為了評估整個激酶組的p97依賴性，測量了單獨使用四個靶向多激酶降解劑以及將其與p97抑制劑CB-5083的共處理後的蛋白質丰度變化。對處理組的分析顯示，響應於降解劑而被下調的幾乎所有激酶在抑制p97時均表現出一定的降解恢復作用，提示大多數可降解的激酶組均以p97依賴性加工；此外，作者比較了募集不同E3連線酶（CRBN，VHL和IAP）的多靶標激酶降解劑的結果，證實了這種p97依賴性獨立於負責泛素化的連線酶。

靶向蛋白質降解是一個快速增長的領域，但降解劑的發展仍然是經驗性的。總的來說，這項研究對激酶組的可降解性進行了廣泛的分析，以解決當前缺乏從中提取TPD介導的降解的一般特徵的資料集的問題。作者將精選的降解劑文庫與基於質譜的定量蛋白質組學相結合，以繪製7種不同細胞系中200多種激酶的可降解性圖譜，這個龐大資料集的建立加速了降解劑化學探針和整個激酶組中臨床上相關的先導化合物的開發。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.038

製版人：十一

參考文獻

1. Bondeson, D.P., and Crews, C.M. (2017). Targeted protein degradation by small molecules. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 57, 107–123.

2. Sakamoto, K.M., Kim, K.B., Kumagai, A., Mercurio, F., Crews, C.M., and Deshaies, R.J. (2001). Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8554–8559.

3. Olson, C.M., Jiang, B., Erb, M.A., Liang, Y., Doctor, Z.M., Zhang, Z., Zhang, T., Kwiatkowski, N., Boukhali, M., Green, J.L., et al. (2018). Pharmacological perturbation of CDK9 using selective CDK9 inhibition or degradation. Nat. Chem. Biol. 14, 163–170.

4. Farnaby, W., Koegl, M., Roy, M.J., Whitworth, C., Diers, E., Trainor, N., Zollman, D., Steurer, S., Karolyi-Oezguer, J., Riedmueller, C., et al. (2019). BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nat. Chem. Biol. 15, 672–680.

5. Ramadan, K., Bruderer, R., Spiga, F.M., Popp, O., Baur, T., Gotta, M., and Meyer, H.H. (2007). Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature 450, 1258–1262.