撰文 | 十一月
責編 | 酶美
RNA結合蛋白TDP-43的錯誤定位以及凝聚會形成細胞核內或者細胞質內的凝聚物，是包括脊髓側索硬化症(ALS)、額顳葉痴呆(FTD)以及阿爾茲海默症(AS)等年齡依賴的神經退行性疾病的重要病理性標記【1-2】。
近日，關於TDP-43再發重磅文章，加州大學聖地亞哥分校Don W.Cleveland研究組與Haiyang Yu（于海洋，第一作者）合作在Science發表Research Article文章，題為HSP70 chaperones RNA-free TDP-43 into anisotropic intranuclear liquid spherical shells，揭開了生理水平下TDP-43在體內形成RNA非依賴的、HSP70分子伴侶調控的不均小體（Anisosomes）的現象，由於該核殼結構存在雙折射率，首次指徵了細胞內液晶結構的存在和形成，為揭開TDP-43在年齡依賴的神經退行性疾病中相分離狀態的調控以及向凝膠狀態以及固態轉化過程提供了重要依據。
十幾年前，科學家們發現蛋白質、核酸或者是兩者的混合物可以分層形成兩相，一個是凝聚相，一個是稀釋相，兩者類似於油醋沙司中的醋和油一樣，該現象被稱為液-液相分離（Liquid-liquid phase separation）【3】。LLPS現象廣泛參與到各種生物學過程之中包括重要的無膜細胞器和無膜結構的組裝，比如中心體、核孔複合物以及超級增強子等等【4-5】。另外，凝聚相可以進一步分層形成膠狀，比如核仁以及paraspeckles的形成等等【6-7】。
在該工作中，作者們介紹了一個有趣的新型LLPS現象，是由RNA結合蛋白TDP-43翻譯後修飾所調控的核殼結構形成的非均質小體。外圍由高濃度的液態的TDP-43組成，內部核心富含HSP70家族分子伴侶，形成了一個“液中有液”的新型液態結構（Liquid-inside-a-liquid-inside-a-liquid）。由於其各向異性和TDP-43在這個獨特的無膜腔的差異分佈，作者們將該小體將其命名為“anisosomes”，這個名字來自希臘語單詞“anisos”和“soma”，意思是“不均勻的身體”。核殼結構表現出雙折射特徵，證實它們是由活細胞內的蛋白質形成的液晶結構。以下筆者將對該文章的內容進行詳細解析。
TDP-43包含一個N端的自組裝結構域，一個C端的低複雜區域LCD以及兩個保守的RNA識別基序（圖1）。與全長的TDP-43形成的“實心”液滴相比，這些RNA結合突變體可以在體內形成非常特別的不均小體結構（圖1）。值得一提的是這些突變體的表達濃度遠低於內源TDP-43初始生理濃度的情況下依然可以形成這樣的不均小體，說明該不均小體的形成並非是由過表達引起的假象。透過熒光漂白恢復實驗，作者們確認了該不均小體的外殼以及核心表現都類似於液態。
圖1 TDP-43的結構域以及不同突變體形成的不均小體
RNA結合結構域突變以及與乙醯化相關的突變體均能在細胞內形成不均小體，因此作者們思考是否是由於乙醯化的動態變化引發不均小體的形成，作者們發現透過施用藥物抑制泛乙醯化酶活性足以驅動內源的TDP-43進入不均小體的外殼結構，增加乙醯化水平也可以驅動相同的結果出現。因此，TDP-43上的乙醯化修飾對於不均小體的形成非常關鍵。另外，因為RNA結合缺陷的TDP-43會被蛋白酶體快速降解，所以作者們在思考抑制蛋白酶體能否促進乙醯化的TDP-43形成不均小體。
的確，在神經元類似細胞中，單獨抑制去乙醯化酶的活性只會造成TDP-43包含的液滴的小部分增長，但是在瞬時地、部分地抑制蛋白酶體的活性後，不均小體的數量以及尺寸會出現顯著地增加。在大鼠和小鼠體內神經元中，降低蛋白酶體的活性也可以驅動不均小體的形成。因此，去乙醯化酶活性的抑制以及蛋白酶體的抑制在體外和體內均會驅動內源的TDP-43形成不均小體。
作者們利用完全消光顯微鏡（Complete extinction microscopy）發現RNA結合缺陷型TDP-43組成的外殼結構是為可見的非膜組分，其中還包括了各項異性的亞結構。而這一特性正暗示了該不均小體的液晶特徵。那什麼是液晶呢？液晶像傳統液體一樣流動，但包含非隨機取向的分子，是可以產生雙折射的各向異性的液體【8】。另外，作者們發現RNA結合缺陷型TDP-43能夠招募內源野生型TDP-43進入不均小體的外殼和內部。
既然在體外和體內均證明了TDP-43不均小體的形成，那這些小體的功能是什麼呢？內部是空心的還是由其他功能性蛋白組成的呢？為了回答這些問題，首先作者們對RNA結合缺陷型TDP-43形成的不均小體在細胞內與其他核內組分的分佈進行了檢測，發現RNA結合缺陷型的TDP-43形成的不均小體會將包括染色質在內的一些結構排除在外。另外，像FUS等RNA結合蛋白也會被排除在外。然而並非所有的RNA結合蛋白均會被排除在外，像hnRNPA2B1、hnRNPH1以及hnRNPK則會自由進出該不均小體結構。說明TDP-43所形成的不均小體對細胞核內的一些組分具有選擇性。
值得一提的是，在細胞進行有絲分裂的時候，細胞內的不均小體仍然能夠完好無損的暴露其中，然後也會被排除在分裂後間期的細胞核之外（圖2）。這與其他大部分現在已經發現的在有絲分裂期間會消失的小體完全不同。
圖2 TDP-43形成的不均小體在有絲分裂仍保持完整
另外，透過建立數學模型，作者們推斷出不均小體內部存在未知的組分。為此，作者們將臨近標記方法與免疫共沉澱以及定量質譜技術相組合，發現不均小體中富含HSP70家族的分子伴侶（圖3）。而且，作者們發現ATP依賴的HSP70分子伴侶活性對於不均小體結構的完整性非常關鍵。
圖3 TDP-43組成的不均小體中富含HSP70家族分子伴侶蛋白
總的來說，作者們發現脊髓側索硬化症相關突變、乙醯化模擬突變或者是增加野生型TDP-43乙醯化的水平均會透過降低TDP-43的RNA結合能力降低其RNA結合驅動的液-液相分離，從而促使RNA結合缺陷型的TDP-43形成不均的、液態的核殼結構。作者們提出的模型說明HSP70家族在不均小體形成中的重要作用——持續的伴侶活性是產生和維持外殼和核心流動性所必需的關鍵因素。TDP-43和HSP70分子伴侶在驅動和維持TDP-43相分離和阻止TDP-43聚集方面是重要的夥伴關係。因此，該研究對於TDP-43相分離介導的年齡依賴的神經退行性疾病的治療和藥物研發提供了新的參考。
原文連結：
https://science.sciencemag.org/content/early/2020/12/16/science.abb4309
製版人： 啟萌之星
參考文獻
1. Neumann, M. et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science (New York, N.Y.) 314, 130-133, doi:10.1126/science.1134108 (2006).
2. Taylor, J. P., Brown, R. H., Jr. & Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature 539, 197-206, doi:10.1038/nature20413 (2016).
3. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A. & Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature reviews. Molecular cell biology 18, 285-298, doi:10.1038/nrm.2017.7 (2017).
4. Woodruff, J. B. et al. The Centrosome Is a Selective Condensate that Nucleates Microtubules by Concentrating Tubulin. Cell 169, 1066-1077.e1010, doi:10.1016/j.cell.2017.05.028 (2017).
5. Hnisz, D., Shrinivas, K., Young, R. A., Chakraborty, A. K. & Sharp, P. A. A Phase Separation Model for Transcriptional Control. Cell 169, 13-23, doi:10.1016/j.cell.2017.02.007 (2017).
6. Feric, M. et al. Coexisting Liquid Phases Underlie Nucleolar Subcompartments. Cell 165, 1686-1697, doi:10.1016/j.cell.2016.04.047 (2016).
7. West, J. A. et al. Structural, super-resolution microscopy analysis of paraspeckle nuclear body organization. The Journal of cell biology 214, 817-830, doi:10.1083/jcb.201601071 (2016).
8. Pelzl, G. & Hauser, A. J. P. T. Birefringence and phase transitions in liquid crystals. 37, 33-62 (1991).