間充質幹細胞屬於成體幹細胞，在體外不同條件下誘導分化為骨、軟骨及其他結締組織，因其來源廣泛，分離無創傷，較低的免疫原性、生長週期短等特點，是組織工程種子細胞的重要來源。幹細胞的誘導分化一方面是幹細胞鑑定的主要方法，另一方面也是幹細胞功能學研究的主要途徑。採用體外條件培養基誘導培養下，人間充質幹細胞應能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細胞。成脂分化經油紅O染色法鑑定，成骨分化經茜素紅染色法鑑定，成軟骨分化經阿爾辛藍染色法鑑定。

產品效能

1.細胞形態

2. 細胞表型

間充質幹細胞P20代細胞表型

流式細胞儀鑑定細胞表型

3.細胞誘導分化

3.1 成脂、成骨、成軟骨誘導分化操作步驟

所需材料

0.05%Trypsin-0.02%EDTA（貨號：CD05-001C）

Phosphate-BufferedSaline (1×PBS) （貨號：BS01-001C）

間充質幹細胞完全培養基（貨號：CM01-001A）

間充質幹細胞成脂誘導分化完全培養基（貨號：DM01-001B）

間充質幹細胞成骨誘導分化完全培養基（貨號：DM02-001B）

間充質幹細胞成軟骨誘導分化完全培養基（貨號：DM03-001B）

成脂誘導分化步驟

注意：本操作規程以六孔板為例

1. 將間充質幹細胞置於37℃，5% CO2的培養箱中培養。

2. 當細胞生長到達對數期時，用0.05%Trypsin-0.02%EDTA進行消化。

3. 將消化下來的間質幹細胞按照2×104 cells/cm2的細胞密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL完全培養基。

4. 將細胞置於37℃，5% CO2的培養箱中進行培養。

5. 每隔三天換液，直到細胞融合度達到100%或者過融合。

6. 小心地將間質幹細胞完全培養基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質幹細胞成脂誘導分化培養基 A 液。

7. 誘導3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL間充質幹細胞成脂誘導分化培養基B液。

8. 24h後，吸走B液，換回A液進行誘導。

9. A液和B液交替作用3-5次後（12-20天），繼續用 B 液維持培養4-7天直到脂滴變得足夠大、圓。B 液維持培養期間，每隔2-3天需要換用新鮮的B液。

成脂（油紅O染色） 成骨（茜素紅染色）

成骨誘導分化步驟

注意：本操作規程以六孔板為例

1. 將間充質幹細胞置於37℃，5% CO2的培養箱中培養。

2. 當細胞融合度達到80-90%時，用0.05%Trypsin進行消化。

3. 將消化下來的間充質幹細胞按照2×104 cells/cm2 的細胞密度接種在事先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL完全培養基。。

4. 將細胞置於37℃，5% CO2的培養箱中進行培養。

5. 當細胞融合度達到60%-70%時，小心的將孔內完全培養基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質幹細胞成骨誘導分化完全培養基。

6. 每隔3天換用新鮮的間充質幹細胞成骨誘導分化完全培養基（使用前需預熱至37℃）

7. 誘導2-4周後，視細胞的形態變化及生長情況，用茜素紅進行染色。

注意：為防止成骨細胞脫落，建議成骨過程中出現大量鈣結節之後，換液形式變為每兩天一次半量換液。

成軟骨誘導分化步驟

1. 進行成軟骨誘導實驗之前，需要對常規消化後的細胞進行計數。

2. 將3-4×105個細胞轉移到15 mL離心管中，250 g離心4 min。

3. 吸去上清，加入0.5 mL預混液，重懸上一步離心所得沉澱，以清洗間充質幹細胞，室溫下150 g離心5 min。

4. 重複步驟3，再次清洗細胞。

5. 將上一步所得沉澱用0.5 mL間充質幹細胞成軟骨誘導完全培養基重懸。

6. 室溫下150 g離心5 min。

7.擰鬆離心管蓋以便於氣體交換，將其放置於37℃，5% CO2的培養箱中培養。

注意：

① 此步驟不要吸掉上清和重懸細胞。

② 24 小時之內不要搖動離心管。

8. 當細胞團出現聚攏現象時（一般為24 h或48 h後，實際視細胞生長情況而定）輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。

9. 自接種開始計算，每隔2-3 d 給細胞換用新鮮的成軟骨誘導完全培養基，每管約0.5 mL成軟骨誘導分化完全培養基。

注意：小心操作，不要吸出軟骨球。

10.換液之後，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。稍加擰鬆離心管蓋放入37℃，5% CO2的培養箱中繼續誘導培養。

11.一般持續誘導21-28天后，可對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，最後進行阿利辛藍染色。

成軟骨（阿利新藍染色）