撰文 | Qi

全腦成像和分子譜分析被廣泛用於研究神經系統發育和腦功能，然而，繪製完整大腦圖譜的一個侷限性是很難在一個密集排布且標記相似的細胞中為每個神經元分配唯一的身份【1,2】。在類似線蟲的簡單神經系統中，識別神經元也是一項挑戰，儘管線蟲神經系統被廣泛認為是“千篇一律”的，但這種固有化並未延伸到神經節內細胞體的相對位置，因此，需要建立一種能穩定識別並標記所有神經元的方法【3】。

2020年12月30日，來自美國哥倫比亞大學霍華德休斯醫學院的Eviatar Yemini課題組在Cell雜誌上發表了一篇題為NeuroPAL: A Multicolor Atlas for Whole-Brain Neuronal Identification in C. elegans 的文章，在這項研究中，作者設計了一種可用於解析所有線蟲神經元身份的“神經多色特徵圖譜（neuronal polychromatic atlas of landmarks,NeuroPAL）”，利用這種手段確定了乙醯膽鹼、GABA和穀氨酸的所有代謝性受體在全腦的表達模式，並揭示了轉錄因子突變引起的細胞命運的改變。此外，作者還記錄了對線蟲對引誘和排斥性化學感覺線索反應的全腦活動，描述了這些刺激的多模式編碼。

秀麗隱杆線蟲（C.elegans）神經系統共包含302個神經元，分佈在全身11個神經節中，雖然每個神經節中的神經元集合在個體之間是相同的，但是每個神經節中神經元胞體的相對位置是可變的。其中，最大的神經節包含大約30個神經元，因而可以推斷，大約需要30種不同的顏色便能可靠地識別每個神經節中的所有神經。由於三個光譜不同的熒光團，在四個或更多不同水平（高，中，低，不可檢測），可以產生至少64種不同顏色。因此，選擇三種熒光團應足以標誌整個秀麗隱杆線蟲神經系統。作者指定TagRFP-T熒光團作為全神經元標記，差異表達另外三個熒光團，分別是mTagBFP2、CyOFP1和mNeptune2.5，以實現特異的神經元識別。需要注意的是，每個神經元需要表達穩定數量的每種熒光團，而每個神經節中的臨近細胞應表達視覺上可區分的熒光團。因此，最終的轉基因由41個不同的報告熒光團融合組成，使得可以根據一種特定的顏色來明確的為秀麗隱杆線蟲中的每個神經元分配身份（見下圖1）。

圖1. NeuroPAL標記線蟲偽彩神經元示意圖

前面已經提到秀麗隱杆線蟲中單個神經元胞體的位置可變性使得僅根據相對位置來分配細胞特性是不可能的，因而NeuroPAL的強大之處之一在於，可以對不同線蟲個體的神經元進行排布分析，測量每個神經元的空間座標，以構建神經元位置變異性的機率圖。

先前的研究已經確認了整個線蟲神經系統的神經遞質表達圖譜，然而，神經遞質受體的表達圖譜在很大程度上仍然是未知的。在此，NeuroPAL可以用來繪製所有代謝型神經遞質受體的完整表達，包括三種膽鹼能代謝型受體（gar-1、gar-2和gar-3）、三種穀氨酸能代謝型受體（mgl-1、mgl-2和mgl-3）和兩種GABA能代謝型受體（gbb-1和gbb-2），並確認這些受體在97%的神經元中表達：70%表達GAR，54%表達MGL，89%表達GBBs。令人驚訝的是，作者發現相當一部分表達GABA受體的神經元不接受突觸前GABA能神經元的任何連線，具體而言，存在31%的GABAA和37%的GABAB受體表達神經元沒有相應的突觸前GABA能伴侶。這些結果表明廣泛的突觸外GABA通訊的存在，而這種突觸外通訊也可能存在於其他代謝型神經遞質受體，例如，3%表達GAR受體的神經元和10%表達MGL受體的神經元分別不接受來自任何穀氨酸能和膽鹼能神經元的突觸輸入。

用來裝配NeuroPAL的41個報告子每一個都是神經元分化特性和身份證明的指標，也就是說，當不同型別的神經元獲得不同的遺傳特性時，影響細胞命運的突變可以引起顏色圖譜的相應改變。因此，NeuroPAL提供了一種快速篩選多種細胞命運的方法。舉例而言，作者揭示了一種泛表達且高度保守的轉錄因子EOR-1/PLZF的神經元命運特異性作用，透過將eor-1無效突變體與NeuroPAL雜交，可以觀察到神經元亞型特異性分化缺陷，背側和腹側的RME神經元失去所有的藍色標記，但仍保留其泛神經元標記。

接下來，為了解決由於先前難以確認神經元身份所引起的線蟲全神經元鈣成像資料分析的難題，作者將NeuroPAL和泛神經細胞表達的鈣離子指示劑GCaMP6s結合起來，研究線蟲對一種排斥性味道（NaCl）和兩種引誘性氣味（2-丁酮和2,3-戊二酮）的全腦反應。全腦成像顯示許多已知和先前未知的神經元對每種刺激的反應，其中包括大量感覺神經元和中間神經元，尤其是沒有已知功能的中間神經元對一到三種化學感覺刺激都表現出顯著反應，甚至是那些突觸孤立的咽部神經系統也對化學感覺訊號的行為反應進行編碼。與此同時，這種全面的神經元識別也有助於研究整個大腦活動和突觸連線組（connectome）的關聯，然而作者並未發現代表神經元通訊功能和結構指標之間的顯著相關性，這可能來自非突觸訊號網路，例如普遍的神經肽能訊號，胺能訊號以及潛在的突觸外訊號，如上述提到的代謝性神經遞質受體表達圖譜所示。

總的來說，這項工作證明了NeuroPAL在基因表達模式、細胞命運和全腦活動成像研究中的多功能性。在研究的最後，作者提供了一個半自動的全腦神經元影象識別軟體包，以及為其他組織或生物選擇報告熒光團的軟體以拓寬NeuroPAL的應用。總之，這種方法打破了因無法鑑別所有神經元型別所導致的難以繪製大腦訊號網路圖譜的瓶頸。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.012

製版人：十一

參考文獻

1. Ahrens, M.B., and Engert, F. (2015). Large-scale imaging in small brains. Curr. Opin. Neurobiol. 32, 78–86.

2. Jones, A.R., Overly, C.C., and Sunkin, S.M. (2009). The Allen Brain Atlas: 5 years and beyond. Nat. Rev. Neurosci. 10, 821–828.

3. White, J.G., Southgate, E., Thomson, J.N., and Brenner, S. (1986). The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 314, 1–340.