撰文 | 陳文強

責編 | 兮

哺乳動物大腦內，功能耦連的神經網路能調控神經元活動性從而響應特定刺激，並進一步調整行為反應。對這一過程的深入理解繼續開發對DNA、RNA等多種水平的短暫細胞事件進行記錄的新型工具，從而幫助我們回答一些重大問題，如相互聯絡的神經細胞型別如何形成網路，或者這些細胞的活動性如何驅動行為事件。

細胞水平的成像技術常用於鑑定與特定行為、經歷相關的細胞亞群。近年來，許許多多研究組已開發多種用於實時檢測熒光訊號的分子探針，不僅能幫助監測神經元對特定刺激 (如視覺刺激) 的實時動作電位訊號，還能監測神經元在某一複雜行為 (如獎賞行為) 下的活動性增加。然而，儘管實時成像技術能在亞秒的時程精確度下記錄一定的活動性範圍，但通常記錄視野範圍有限，有時需要透過轉錄組測序等其他方法來輔助尋找分子特徵。因此，我們亟需一種基於鈣訊號、又具有時程精確度的技術對特定細胞進行活動性標記。

近日，來自美國斯坦福大學的Alice Ting團隊聯合Karl Deisseroth團隊的研究人員在Cell雜誌線上發表了題為A Molecular Calcium Integrator Reveals a Striatal Cell Type Driving Aversion 的研究論文，開發了一種名為FLiCRE的新型工具以用於檢測細胞型別特異性的神經活動性，鑑定了伏隔核內驅動行為厭惡反應的短暫啟用神經元特徵，從而幫助我們更好地從分子細胞水平了解行為背後的分子生物學機制。

在這一概念的指導下，研究人員開發了名為Fast Light and Calcium-regulated Expression(FLiCRE) 的工具 (圖1)。在基礎水平下 (即無光照/低鈣水平)，轉錄因子Gal4透過一系列分子(CD4、MKII、LOV和TEVcs) 與細胞膜連線在一起。LOV用於在未啟用狀態下捆住TEVcs。而在胞漿內，蛋白酶uTEVp與鈣調蛋白 (CaM) 融合在一起。在高鈣狀態下，CaM和MKII發生相互作用，將uTEVp帶進TEVcs附近，當存在藍光照射啟用LOV的情況下，TEVcs才能得到清除。這一巧妙設計使得在藍光照射和細胞內高鈣水平下，Gal4釋放並轉位至細胞核，從而驅動報告基因UAS的表達。

圖1. FLiCRE的設計原理

研究人員使用tTA替代Gal4、使用Neurexin3B替代CD4、使用TRE-mCherry作為報告基因替代了UAS，進一步在體外培養皮層神經元中鑑定了FLiCRE工具的高敏感性 (圖2)。透過間隔1min的交錯藍光/電刺激，研究人員發現FLiCRE標記近在藍光和電刺激同村遞送的情況下產生，而此前名為Cal-Light的類似工具【1】缺乏類似的時程精確度來區分不同刺激。

圖2. FLiCRE的體外時程精確度驗證

研究人員也在在體水平驗證了FLiCRE (圖3)。透過AAV病毒注射，研究人員將FLiCRE和TRE-mCherry表達於野生型小鼠的中腦腹側被蓋區 (VTA)，透過腹腔注射尼古丁並同時用藍光照射VTA達15分鐘。18小時後，研究人員分析了TRE-mCherry的表達。結果表明，TRE-mCherry表達僅在尼古丁刺激與藍光照射情況下游最大表達，表明FLiCRE可被用於在體的單個行為刺激標記。隨後用光遺傳技術啟用神經元活動性後同樣能增加TRE-mCherry表達。

圖3. FLiCRE的在體功能驗證

因為FLiCRE能驅動mCherry在啟用神經元的表達，因此，研究人員認為這一外源性引入的報告基因轉錄子可被用於透過單細胞測序來檢測FLiCRE啟用神經元的特徵。此前僅有一項報告使用成熟神經元單細胞測序用於特定轉錄子的檢測【2】。研究人員用光遺傳技術刺激Thy1::ChR2小鼠的穀氨酸能神經元，收集並對近1萬個伏隔核神經元進行單細胞測序，發現FLiCRE相關轉錄子均在神經元型別中富集，說明光遺傳刺激穀氨酸能神經元，從而啟用伏隔核神經元並表達TRE-mCherry轉錄子。

圖4. 使用單細胞測序檢測FLiCRE啟用情況

研究人員進一步想了解的是，TRE-mCherry能特異性表達在哪些神經元亞群呢？透過將表達有mCherry、tTA、或uTEVp的神經元分類，研究人員發現mCherry陽性神經元主要富集於D1-MSN亞群，相關標記基因也得到進一步揭示 (如Tac1、Calb1等)，也就是說，Thy1::ChR2小鼠的興奮性神經元軸突主要啟用下游NAc神經元的表達Tac1和Calb1的特定亞群細胞。而這一特定神經元亞群是否具有和獎賞行為相關的功能呢？研究人員更一進步改變FLiCRE的設計，用紅移光遺傳陽離子通道bReaChES替代mCherry，從而可以使用橙光啟用下游NAc神經元 (圖5)。使用實時條件性位置偏好實驗，研究人員發現啟用這類神經元后產生行為厭惡效應，表現在小鼠迴避伴有橙光刺激的刺激箱。

圖5. 使用FLiCRE標記之前啟用的神經元並控制其行為效應

本文報道的FLiCRE工具為光控鈣整合器，可更進一步揭示短暫啟用的細胞的轉錄組特徵，這與此前使用的多種細胞內鈣指示劑及其他探針【3-4】有著很大不同。FLiCRE和其他鈣整合器還能更進一步揭示啟用細胞的分子特徵並能受到功能操控，因此，本文所報道的FLiCRE有助於對短暫啟用的神經元進行進一步的轉錄組和功能特徵的鑑定。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.015

製版人：十一

參考文獻

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