撰文 | Qi
皮質-運動通路（cortico-motor pathway）的主要功能是調節後腦和脊髓的神經活動，以產生協調運動。大腦皮層中的皮質下行穀氨酸能神經元傳送長程軸突來調節後腦和脊髓的網路，最終誘導肌肉收縮。而外傷、肌萎縮性側索硬化症或自身免疫性疾病後皮質運動迴路的損傷或退化會導致嚴重的運動功能障礙【1,2】。誘導性多能幹細胞在建立個性化疾病模型方面有廣闊前景，儘管皮質-脊髓-運動通路的組分已在分離情況下產生及研究，但這一系統的體外衍生和裝配尚未在人類細胞中實現。
先前，已經開發出生成特定區域的球狀體（spheroids）或類器官（organoids），並在體外將其融合成為三維裝配體（3D assembloids），來模擬人腦發育過程中複雜的細胞相互作用【3,4】。截至目前，儘管已在皮質-丘腦裝配體、器官型小鼠共培養和使用切片皮質類器官和齧齒類動物脊髓外植體的製備中觀察到了長程神經投射，然而，在體外從人類細胞中衍生出和組裝完成功能性多突觸迴路的想法尚未實現【5-7】。
近日，來自美國斯坦福大學醫學院的Sergiu P. Pașca課題組在Cell雜誌上發表了一篇題為 Generation of Functional Human 3D Cortico-Motor Assembloids 的文章，在這項研究中，作者獲得類似於大腦皮層和後腦/脊髓的類器官，並將它們與人類骨骼肌類器官組合在一起，產生3D皮質-運動裝配體，並透過狂犬病追蹤、鈣離子成像和膜片鉗記錄等手段，證實皮質下行神經元投射與脊髓類器官相連，而脊髓源性運動神經元與肌肉相連這一通路。此外，穀氨酸釋放（Glutamate uncaging）或對皮質球狀體的光遺傳刺激可引起3D肌肉的強烈收縮，而裝配體在形態和功能上均可在融合後10周內保持完整。總之，該系統突出了3D培養物的顯著自組裝能力，以及潛在的可用來了解人類發育和疾病功能迴路的能力。
首先，作者調整不同方案以從人類誘導性多能幹細胞（human-induced pluripotent stem, hiPS）中生成類似人類後腦/頸脊髓(hindbrain/cervical spinal cord, hSpS) 的球狀體，並透過不同的神經元標誌物進行驗證。為了生成皮質-脊髓裝配體（cortico-spinal assembloids），作者將hSpS與感染AAV-hSYN1:: eYFP報告基因的人類皮質球狀體（human cortical spheroids, hCS）融合，於融合後5天透過實時成像觀察到hCS中的細胞向hSpS延伸的過程，隨後的免疫細胞化學也顯示出hSpS中出現源自hCS的投射。
圖1. hCS-hSpS裝配體的生成以及皮質-脊髓投射的表徵
為了確定源自hCS投射神經元的特異性，作者使用了逆行狂犬病毒追蹤方法（retrograde rabies tracing approach），分別用攜帶Cre-eGFP重組酶的ΔG-狂犬病毒和攜帶跨突觸傳播所需的狂犬病毒糖蛋白(G)的AAV感染hSpS，以及使用編碼DIO-mCherry的AVV感染hCS，並觀察到hSpS和hCS中GFP的廣泛表達。接下來，作者使用光遺傳和鈣離子成像來探測源自hCS的投射是否形成了功能連線，因此在組裝前透過AAV病毒分別將光敏視蛋白Chrimson轉入hCS，並將基因編碼的鈣指示劑GCaMP7s轉入hSpS，透過光纖將短脈衝紅光傳遞給hCS後約200 ms，十個裝配體中有四個的hSpS神經元發生響應。
與此同時，為了驗證hCS的皮層神經元與hSpS的運動神經元突觸連線，作者進一步在hCS-hSpS裝配體上完成電壓鉗記錄實驗。作者透過使用AAV1-Syn1::Chrimson-mCherry感染hCS，並使用hSpS中的Hb9::GFP報告基因視覺化運動神經元，發現連續的光刺激Hb9+ 細胞周圍區域可以產生可靠的突觸後電流，而這些反應可能被TTX阻斷，這表明它們可能是由單突觸或雙突觸連線的hCS神經元軸突的動作電位觸發的。這些資料提示，hCS中的皮質下行神經元與hSpS中的神經元產生了突觸連線。
皮質-運動迴路的功能輸出是透過運動神經元活動的肌肉收縮實現的，為了探討hSpS調節人體肌肉細胞活動的能力，作者使用從成人肌肉活檢中提取的人類骨骼成肌細胞 (we used human skeletal myoblasts, hSkM)，並將hSpS置於貼壁培養的hSkM之上。使用鈣指示物Cal-590活體成像，作者發現hSpS -hSkM中活性hSkM的比例比hSkM單獨培養或與hCS共培養的hSkM增加了一倍。隨後，作者將完整的hCS與hSpS和hSkM融合並驗證自發性收縮在hSkM中的存在，類似地，hSpS-hSkM和hCS-hSpS-hSkM裝配體相較於hSkM單獨或hCS-hSkM裝配體而言顯示出更多的自發性收縮。此外，穀氨酸解籠鎖以光刺激裝配體中的hCS會引起強烈的肌肉收縮反應，這提示皮質-脊髓-肌肉功能性單元的裝配成功，相反，如果僅刺激hCS-hSkM中的hCS不會引起反應，表明皮層刺激後的引發的肌肉收縮依賴於hSpS的存在。由於這些實驗的hSkM來源於成人肌肉，作者想知道這一裝配體是否可以完全來源於hiPS細胞？作者透過生成hiPS細胞來源的骨骼肌成肌細胞（ihSkM），依照上述在原代成肌細胞中完成的程式，並生成完全hiPS細胞來源的功能性裝配體。
傳統的運動神經元和肌肉共培養並不適合長期實驗，因為隨著時間的推移細胞往往會發生分離。然而，在這項研究中，作者發現hCS-hSpS-hSkM裝配體可以保持在培養環境中長達10周而不發生結構解體。那麼在這期間，裝配體的功能性是否會隨時間推移而降低呢？為此，作者生成hSCAAV-Chrim-hSpS-hSkM裝配體，並在第5周和第8周進行光刺激，結果顯示hSkM在兩個時間點都發生收縮，儘管在第8周時收縮率有所下降，然而在連續5次刺激之後，第8周時的裝配體更有可能發生反覆收縮，提示長期培養後反應更強烈。
這篇文章的通訊作者，精神病學和行為科學副教授Sergiu Pasca表示：“ALS在齧齒類動物身上已經治癒了幾十次，然而沒有一種療法能有效地轉化到人類患者身上。但現在我們可以利用患者自己的細胞生成個性化的工作模型，幫助我們在培養皿中研究這些疾病”。這番話正巧也是這項工作的重點及亮點所在，研究人員所建立的皮質-運動裝配體可用於追蹤解剖和功能連線，能夠在體外長期維持以捕捉細胞和功能的變化，並可在多個層面進行光遺傳或藥理學操作以控制人體肌肉收縮。由此擴充套件到中樞神經系統不同區域的裝配體構建，可以為理解不同型別的人體迴路的裝配和識別治療策略帶來深刻的見解。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.017
製版人：十一
參考文獻
1. Lemon, R.N. (2008). Descending pathways in motor control. Annu. Rev. Neurosci.31, 195–218.
2. Blesch, A., and Tuszynski, M.H. (2009). Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41–47.
3. Birey, F., Andersen, J., Makinson, C.D., Islam, S., Wei, W., Huber, N., Fan, H.C., Metzler, K.R.C., Panagiotakos, G., Thom, N., et al. (2017). Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature 545, 54–59.
4. Pas xca, S.P. (2019). Assembling human brain organoids. Science 363, 126–127.
5. Xiang, Y., Tanaka, Y., Cakir, B., Patterson, B., Kim, K.Y., Sun, P., Kang, Y.J., Zhong, M., Liu, X., Patra, P., et al. (2019). hESC-Derived Thalamic Organoids Form Reciprocal Projections When Fused with Cortical Organoids. Cell Stem Cell 24, 487–497.
6. Takuma, H., Sakurai, M., and Kanazawa, I. (2002). In vitro formation of corticospinal synapses in an organotypic slice co-culture. Neuroscience 109, 359–370.
7. Giandomenico, S.L., Mierau, S.B., Gibbons, G.M., Wenger, L.M.D., Masullo, L., Sit, T., Sutcliffe, M., Boulanger, J., Tripodi, M., Derivery, E., et al. (2019). Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat. Neurosci. 22, 669–679.