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肉毒素是一類由革蘭氏陽性菌肉毒桿菌（Clostridium Botulinum）及同屬相近菌所產生的蛋白質毒素。該毒素家族目前已知有七種亞型（BoNT/A到BoNT/G）【1】。該類毒素是目前自然界中已知的毒性最高的毒素之一。在美國，肉毒素被列為六類最危險的管制藥物之一，是潛在的生物恐怖襲擊製劑 (Arnon et al., 2001)。這類神經毒素特異性的靶向宿主運動神經，阻斷神經遞質的傳遞，造成肌肉麻痺和鬆弛性癱瘓，導致病人行動無力和無法呼吸。七種亞型中，BoNT/A和BoNT/B所導致的肉毒桿菌中毒居多。得益於肉毒素對運動神經元的特異性，A和B亞型也被越來越多的用於治療由神經過度興奮引發的肌肉障礙相關的各種疾病。肉毒素為大眾所熟知的應用是在美容上用於消除皺紋。肉毒素家族蛋白是由單一基因編碼的雙鏈蛋白，該蛋白在合成後需由蛋白酶啟用從而切割成兩條鏈，包括輕鏈和重鏈。輕鏈由蛋白酶結構域組成，其本身是一種蛋白酶，可以特異性的切割神經元內負責囊泡與細胞膜融合的相關蛋白，包括VAMP1，2和3，SNAP-25以及Syntaxin 1。正是由於輕鏈的這一特性，它是肉毒素能夠阻斷神經訊號傳遞的最終執行者。重鏈包含兩個結構域，位於N端的跨膜區及C端的受體結合區。在蛋白質結構層面上，三個結構域相對獨立，分工明確。受體結合結構域負責識別在神經元上的特異受體；跨膜結構域協助輕鏈轉移到細胞內部；輕鏈在胞質內切割底物從而阻斷神經遞質的釋放。對於治療由BoNT/A與BoNT/B所導致的肉毒桿菌中毒，其主要的難點在於毒素進入神經元后其輕鏈在細胞質中的半衰期極長，從而導致持續性的神經阻斷及肌肉癱瘓。這些症狀可以持續數月，臨床上還沒有藥物能夠抑制已經進入神經元內的毒素。一旦中毒，病人需要得到深度護理及輔助性的呼吸裝備得以維持生命，這一過程長達數週至數月不等。由於週期長，肉毒桿菌中毒的治療會導致高昂的醫療費用。而且一旦遇到大規模爆發，極易導致醫療設施的短缺。開發治療肉毒桿菌中毒的藥物的研究由來已久，但迄今為止，還沒有小分子藥物能在神經元內有效的抑制肉毒素的酶活性。抗體藥物也僅能中和迴圈系統中存留的毒素。2020年1月7日，哈佛醫學院和波士頓兒童醫院的董民博士的實驗室在Science Translational Medicine線上發表了題為“Delivery of single-domain antibodies into neurons using a chimeric toxin–based platform is therapeutic in mouse models of botulism”的文章，該研究用蛋白工程的方法開發了以融合毒素為平臺將奈米抗體遞送至神經元細胞內來治療肉毒桿菌中毒，為快速有效的治癒肉毒桿菌中毒迎來了新的曙光。

在此項研究中，作者充分利用了肉毒素極高的神經特異性，用基因工程突變的方法開發了失去毒性的肉毒素，並用其為載體將奈米抗體遞送至神經元細胞內去中和A亞型和B亞型毒素。在此之前，已有其他實驗室嘗試過利用失活的BoNT/A 和BoNT/C等傳統肉毒素亞型作為藥物遞送工具。儘管這些載體在經過突變後在體外並不具有酶活性，但被注射到小鼠體內後，小鼠仍然表現出肉毒桿菌中毒的症狀及死亡，其背後機制尚不明朗。為解決這一安全性上的問題，董民博士的實驗室另闢蹊徑，嘗試改造了一種新發現的肉毒素亞型BoNT/X。這種毒素是董民博士的實驗室於2017年發現的一種新型類肉毒素，具有很多特別的生化特性，包括更廣譜的底物切割及更高效的轉膜結構域 (Zhang et al., 2017)。因為BoNT/X本身不靶向運動神經元，作者只利用了X型毒素的蛋白酶結構域和跨膜結構域作為藥物跨膜轉運工具，同時用A, C, D肉毒素亞型的受體結構域來靶向運動神經元， 從而產生了人造的嵌合型肉毒素（稱作BoNT/XA，BoNT/XC和BoNT/XD）， 並透過突變關鍵的X型毒素酶活性位點的方法去除毒性用以作為遞送載體。在將針對A亞型的奈米抗體（A8）與去除毒性的BoNT/XA，BoNT/XC和BoNT/XD融合後（下文稱作A8-ciBoNT/XA，A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD，見圖一），作者首先在體外培養的神經元上對其進行了測試，發現這些融合蛋白均能有效的抑制已進入神經元內的A亞型毒素的活性， 其中以A8-ciBoNT/XA的抑制效果最佳。接下來作者對這些融合蛋白在小鼠內的毒性進行了評估。當給小鼠注射100 mg/kg的A8-ciBoNT/XA，A8-ciBoNT/XC和A8-ciBoNT/XD時，小鼠仍然無任何中毒症狀， 從而解決了一直以來困擾的殘餘毒性問題。

圖一：嵌合蛋白的構建和作用機理

作者然後以小鼠為模型及利用不同的給藥方式對A8-ciBoNT/XA的藥效進行了進一步的評估。在對小鼠的後肢進行區域性注射BoNT/A後，該後肢會呈現出鬆弛性癱瘓症狀，在沒有藥物干預的情況下，該症狀會持續長達約40天至消失。在先注射BoNT/A後18小時，在相同的部位再次注射0.6微克的A8-ciBoNT/XA後，肉毒素造成的區域性肌肉麻痺在幾小時內開始緩解， 小鼠在2天內即可完全恢復正常。作者然後透過給小鼠腹部注射致死劑量的BoNT/A以誘發全身性的中毒症狀，約9小時後小鼠即呈現出行動困難。在無藥物干預的情況下，數小時後小鼠即表現出無法行動和呼吸困難。在注射BoNT/A後9小時，再透過腹部注射30微克A8-ciBoNT/XA，小鼠的中毒症狀在6小時內消失並恢復正常的行動能力（見圖二）。

圖二：A8-ciBoNT/XA能有效的治癒BoNT/A引發的全身性肉毒桿菌中毒

最後作者採用一石二鳥的策略，將兩個能分別中和BoNT/A與BoNT/B的奈米抗體（A8和J10）同時融合到消除毒性的BoNT/XA（蛋白稱作A8-J0-ciBoNT/XA）。在小鼠模型中， A8-J0-ciBoNT/XA可以同時治癒由BoNT/A和BoNT/B引發的肉毒桿菌中毒。該研究第一次建立了可以在肉毒素中毒症狀出現以後的治療方法。同時在臨床上也可以用來快速消除由於不當使用肉毒素造成的肌肉麻痺，從而為肉毒素的安全使用提供了新的保障。這項研究也建立了一套有效的蛋白藥物遞送工具，可以把蛋白藥物特異性的靶向神經元，並且高效的跨膜進入細胞內部。這一技術有潛力廣泛的應用於遞送蛋白藥物到靶向細胞內部，從而可以突破目前的蛋白藥物只能針對細胞表面靶點的侷限性，讓開發針對細胞內的藥物靶點的蛋白藥物成為可能。 董民博士的實驗室在肉毒素領域深耕多年，在多個方面均有重要的發現，如肉毒素受體的鑑定及其識別機制和開發醫用上更高效肉毒素。同時實驗室還先後發現兩個新的類肉毒素，本研究中所採用的BoNT/X就是其中之一，均具有較高藥用價值。

原文連結https://stm.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/scitranslmed.aaz4197

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參考文獻

1. Dong, M., Masuyer, G., & Stenmark, P.(2019). Botulinum and tetanus neurotoxins. In Annual Review of Biochemistry.https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-013118-111654

2. Arnon, S. S., Schechter, R., Inglesby, T. V.,Henderson, D. A., Bartlett, J. G., Ascher, M. S., Eitzen, E., Fine, A. D.,Hauer, J., Layton, M., Lillibridge, S., Osterholm, M. T., O’Toole, T., Parker,G., Perl, T. M., Russell, P. K., Swerdlow, D. L., & Tonat, K. (2001).Botulinum toxin as a biological weapon: Medical and public health management. Journalof the American Medical Association.https://doi.org/10.1001/jama.285.8.1059

3. Zhang, S., Masuyer, G., Zhang, J., Shen, Y.,Henriksson, L., Miyashita, S. I., Martínez-Carranza, M., Dong, M., &Stenmark, P. (2017). Identification and characterization of a novel botulinumneurotoxin.Nature Communications, 8.https://doi.org/10.1038/ncomms14130