撰文 | 木蘭之枻責編 | 兮
所有正常的免疫系統都具有區分“自我”和“非我”的能力：免疫系統可以透過自我調節，在有效殺傷外源病原體的同時避免自身免疫病的發生【1】。作為原核生物的適應性免疫系統，CRISPR-Cas系統同樣具有自我調節能力。已有研究指出，面對噬菌體感染、膜應激和代謝壓力等內外源刺激，CRISPR-Cas系統的表達水平會發生明顯改變【2】，但具體的調控機制並不明瞭。
近日，來自美國約翰霍普金斯大學醫學院的Joshua W. Modell實驗室在Cell發表題為A natural single-guide RNA repurposes Cas9 to autoregulate CRISPR-Cas expression的論文。文章對細菌中CRISPR-Cas系統表達的自我調控機制進行了研究，發現細菌中天然存在一種單鏈嚮導RNA tracr-L，它能募集Cas9抑制其自身啟動子的轉錄，從而實現CRISPR-Cas系統表達的自我調節。該自我調控機制在II-A型CRISPR-Cas系統中廣泛存在：如果解除抑制，CRISPR-Cas系統介導的免疫活性會上調3000倍，但也會引發嚴重的自體免疫毒性。
為探尋CRISPR-Cas系統的調控因子，研究者選用表達釀膿鏈球菌（S. pyogenes） II-A型CRISPR-Cas9系統的金黃色葡萄球菌（S. aureus）的雜合體系，透過轉座子突變測序（Tn-seq）技術開展遺傳篩選。結果顯示，CRISPR基因座內部位於tracr-L啟動子和5’末端的區域對CRISPR-Cas系統的免疫功能至關重要：該區域被破壞後，相關的免疫功能明顯增強。已知該區域表達一種名為tracr-L的非編碼RNA，研究者對tracr-L在CRISPR-Cas系統免疫功能調控中的角色進行分析，發現tracr-L能破壞CRISPR-Cas系統間隔序列的獲取並抑制各組分的表達，最終抑制其免疫功能。
進一步的研究指出， tracr-L能直接結合Cas9蛋白抑制Cas9基因內源性啟動子Pcas的活性，這源自tracr-L 5’端對Pcas轉錄起始位點附近序列的識別和結合（識別序列長度為11bp且PAM位點為NGG，可保證tracr-L-Cas9複合物可結合在該區域但不會發生切割）。研究者還指出，tracr-L本身便會形成類似於單鏈嚮導RNA的結構以發揮功能，其對Pcas啟動子的抑制機制類似於sgRNA-dCas9複合物對基因轉錄的抑制 （圖1）。
已知II-A型CRISPR-Cas系統的免疫功能依賴於Cas9蛋白和兩種非編碼RNA，即tracrRNA和crRNA，其中tracrRNA分tracr-S和tracr-L兩種。正常條件下，tracr-S結合並介導crRNA前體（pre-crRNA）的加工成熟，進而結合Cas9蛋白髮揮功能。之前研究者對tracr-L與crRNA的關係缺乏瞭解。本研究指出，pre-crRNA並不結合tracr-L，但成熟後的crRNA能結合並干擾tracr-L對Pcas啟動子的抑制。此外，crRNA-tracr-S可與tracr-L競爭性結合Cas9蛋白，進一步降低其對Pcas啟動子活性的抑制。因此，tracr-L對Pcas啟動子活性的抑制還存在crRNA介導的反饋調控機制，從而讓調控機制更加完善。
研究者還發現，tracr-L對Pcas啟動子活性的抑制能夠在保證識別殺傷外源病毒入侵的同時避免自體免疫毒性的出現。此外，系統分析指出，34/80種II-A型CRISPR-Cas系統中均有tracr-L的存在，其功能很可能是參與對Cas基因轉錄的調控，這表明tracr-L對Pcas啟動子活性的調控在II-A型CRISPR-Cas系統中具有普遍性。
圖1 tracr-L對Pcas啟動子活性的調控機制
總體而言，本研究以釀膿鏈球菌（S. pyogenes）的II-A型CRISPR-Cas9系統為研究物件，發現了一種天然的單鏈嚮導RNA tracr-L，可以直接結合Cas9蛋白並抑制其自身啟動子的轉錄，從而調控CRISPR-Cas9系統的免疫功能。這一內在的自我調控機制在II-A型CRISPR-Cas系統中普遍存在，這有助於CRISPR-Cas系統在識別殺傷外源病毒入侵的同時避免自體免疫毒性的出現。此外，這一結果對於Cas9工具的開發也有重要的指導意義：在保證Cas9工具功能的同時儘可能減少其毒副作用將有助於工具的臨床轉化應用。
原文連結https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.017
製版人：琪醬
參考文獻
1. Gasteiger, G., and Rudensky, A.Y. (2014).Interactions between innate and adaptive lymphocytes. Nat. Rev. Immunol. 14,631–639.2. Patterson, A.G., Yevstigneyeva, M.S., and Fineran, P.C. (2017). Regulation ofCRISPR-Cas adaptive immune systems. Curr. Opin. Microbiol. 37, 1–7.