【背景介紹】

DNA基序提供了一個強大的工具箱，可用來模仿生物系統的功能複雜性。確實，當前具有DNA連線主題的材料在諸如軟機器人，治療和細胞培養水凝膠，可程式設計熒光機械感測以及響應生物輸入的材料等應用中顯示出越來越先進的效能。但是，目前缺乏對寡核苷酸結構單元的大規模合成途徑阻止了DNA材料的廣泛應用。儘管在生物技術生產和複製技術方面取得了重大進步，但用於DNA和RNA的最廣泛，最通用的合成技術是基於亞磷醯胺化學的固相寡核苷酸合成（SPOS）。使用不溶性支援物在自動合成儀上進行4步核苷酸加成迴圈-偶聯，帽化，氧化，脫保護/去三苯甲基化。這種流化學方法的異質性有助於快速自動合成多達200個核苷酸的序列，但存在一些可擴充套件性限制（尤其是在實驗室環境中）和較高的試劑消耗。作為一種替代策略，液相寡核苷酸合成（LPOS）使用均質反應混合物，原則上具有無限的可擴充套件性，並且需要的試劑過量非常少。在LPOS中，寡核苷酸是從可溶性支援物中生長出來的，可在每個步驟後透過沉澱，萃取，色譜或納濾將其從反應混合物中分離出來。其中最突出的方法是高效液相（HELP）方法，它使用聚乙二醇（PEG）載體，該載體在每個步驟後都會沉澱出來。

【科研摘要】

基於亞磷醯胺化學的固相寡核苷酸合成（SPOS）是目前最廣泛的DNA和RNA合成技術，但存在可擴充套件性限制和試劑消耗高的問題。液相寡核苷酸合成（LPOS）使用可溶性聚合物載體，具有可擴充套件的潛力。但是，目前，LPOS每新增一個核苷酸需要3個獨立的反應步驟和4-5個沉澱步驟。此外，由於脫嘌呤和鏈斷裂，在脫保護步驟期間長的酸暴露時間使具有高A含量（腺嘌呤）的序列降解。先前，弗萊堡大學Andreas Walther教授團隊提出了第一個單鍋液相DNA合成技術，該技術允許在一鍋中依次偶聯，氧化和脫保護的一個反應中新增一個核苷酸，然後進行單個沉澱步驟。相關論文Scalable One-Pot-Liquid-Phase Oligonucleotide Synthesis for Model Network Hydrogels發表在《J. Am. Chem. Soc.》上。此外，作者展示瞭如何在新增腺嘌呤核苷酸的過程中抑制去嘌呤。作者展示了該技術在克數制下製備高純度4臂PEG-T20（T =胸腺嘧啶）和4臂PEG-A20構件的潛力。這種互補的4-臂PEG-DNA構件可逆地自組裝成超分子模型網路水凝膠，並有助於闡明鍵的壽命。這些模型網路水凝膠在室溫下（在44°C的溫度下熔化）在DNA鍵中展現出新的機械效能水平（儲能模量，鍵壽命），從而為透過序列識別可程式設計的下一代DNA材料開闢了途徑，可用於大規模應用。

作者提出了一種單液液相寡核苷酸合成（OP-LPOS）的第一種合成策略，並使用此方法制備了兩個不同的4臂PEG-DNA構建基塊，每個臂中有20個寡核苷酸，在10– 20 g秤（示意圖1）。將一個核苷酸新增迴圈所需的三個步驟（偶聯，氧化和去三苯甲基化）合併為一鍋法，並依次新增試劑，通常僅需一次沉澱即可在完全新增一個核苷酸後以高純度回收產物。作者專注於胸腺嘧啶和腺嘌呤同系重複序列，因為它們允許透過雙鏈體形成進行互補相互作用，並且因為腺嘌呤在脫嘌呤和鏈斷裂方面是最具挑戰性的鹼基。確實，作者對條件，試劑和取代效果的詳細研究使人們可以抑制A核苷酸的去嘌呤和主鏈裂解，並可以清潔液相合成4臂PEG-A20。然後，將這些互補的組成部分（4臂PEG-T20和4臂PEG-A20）組合在一起，以研究雜交的T20-A20雙鏈體，將其作為具有出色機械強度的自立模型網路水凝膠的機械連線。

示意圖1.在4-Arm PEG上進行一鍋液相寡核苷酸合成（OP-LPOS）的概念。

【圖文解析】

一鍋寡核苷酸新增

液相寡核苷酸合成（LPOS）的主要瓶頸是每個步驟中試劑的不相容性，以及在偶聯，氧化和去三苯甲基化步驟後需要重複沉澱和過濾，這是勞動密集型的，並導致產品損失。作者對已建立的在偶聯後直接在一鍋法中直接繼續進行的方法的主要改進是替換了常用的氧化劑叔丁基過氧化氫（TBHP），文獻報道該化合物可氧化分離出的偶聯產物，隨後 透過另一個沉澱步驟（圖1a–c）。確實，首先嚐試透過在耦合步驟後將TBHP直接新增到反應混合物中而不除去過量的亞磷醯胺或ETT的方式，在一鍋耦合和氧化中進行經典TBHP。但是，通常使用過量50倍的TBHP（相對於亞磷醯胺）會導致副產物的形成（圖1d–f，頂部）。最後的反應步驟是去除DMT保護基（去三苯甲基化）。這是一個挑戰，因為它是一個平衡反應，通常會導致LPOS中的不完全三苯甲基化（圖1g）。

圖1.比較當前文獻方法（左）與一鍋核苷酸加成方法（右）的液相on-PEG寡核苷酸合成。

4-臂PEG-T20的多重譜合成

建立用於將第一個T核苷酸新增到4臂PEG-OH上的OP-LPOS技術後，使用該技術為具有目標20個核苷酸序列的可程式設計DNA材料製備了高質量的構建基塊。為了合成4臂PEG-T20，作者將OP-LPOS進行20遍4臂PEG-OH（Mn，MALDI = 41170 g/mol，Đ= 1.04）（圖2a）。每個偶聯步驟均使用3倍過量的亞磷醯胺和12倍過量的ETT與OH基團進行60分鐘，分別以100和250 mM的無水乙腈溶液形式新增。為了監測T20的生長，在每個步驟之後，對中間樣品進行DMSO-d6 NMR光譜測量，最終1H NMR光譜顯示產物不含雜質（圖2c）。與PEG相比，T的量略高於在隨後的合成步驟中預期的量，其來源將在下面進一步討論。最初的18.9 g規模合成，得到9.0 g 4臂PEG-T20（圖2b），整個合成過程中總共收集了10.2 g樣品。

圖2.透過重複20次的OP-LPOS從4臂PEG-OH合成4臂PEG-T20。

合成中去嘌呤的抑制

構建側重於由兩個相互作用的4臂PEG-DNA星型聚合物形成的模型網路的DNA材料需要合成互補的4臂PEG-A20。實際上，具有大量腺嘌呤核苷酸的序列（在這種情況下，每4個臂PEG為80個）仍然是LPOS的主要瓶頸，因為酸催化的去三苯甲基化所需的長時間酸暴露時間會引起去嘌呤化（去除腺嘌呤或鳥嘌呤核苷鹼基）;均為嘌呤核苷鹼基）。反過來導致後處理斷鏈（圖3a）。特別地，最普通的A-核苷酸亞磷醯胺（具有苯甲醯基保護基）易於去純化。在SPOS中這無關緊要，因為連續沖洗掉裂解的DMT基團會加速部分可逆的脫保護作用（圖3b），並使酸暴露最小化。為了解決此問題並促進4臂PEG-A20的合成，作者首先討論了OP-LPOS的最佳化，以防止苯甲醯基保護的A的去純化作用。為了最佳化OP-LPOS並最大程度地減少脫嘌呤，因此確定了在一鍋新增苯甲醯基保護的A-亞磷醯胺到4臂PEG-OH中各種條件下的脫三苯甲基化和脫嘌呤反應速率。透過在一定時間間隔內收集樣品並測量1H NMR來監測去三苯甲基化和去嘌呤的程度，以確定PEG端基對PEG臂的DMT（4H）和腺嘌呤（2H）的殘留量（圖3c和3d突出顯示 彩色的箭頭）。這兩個反應均遵循一階動力學且具有較高的準確度（圖3e）。

圖3.抑制腺嘌呤核苷酸的去嘌呤副反應。

4-臂PEG-A20克數量級規模的合成

4-臂PEG-A20的合成以與4-臂PEG-T20類似的方式進行，但是主要區別是去三苯甲基化條件。作者從相同的4臂PEG-OH（Mn，MALDI = 41,170 g/mol，Đ= 1.04）開始，並用Bz保護的A-亞磷醯胺再次重複OP-LPOS 20次（圖4a）。經過20個單鍋核苷酸新增步驟後，加入10.1 g的4-臂PEG-OH，分別得到3.4 g帶有腺嘌呤和磷酸鹽上的Bz和CE基團的4-臂PEG-A20（圖4b），以及一個附加的 在整個合成過程中收集到4.1 g樣品。圖4c顯示了不含雜質的最終產物（腺嘌呤和磷酸鹽保護的）的1H NMR光譜。與上述相似，4臂PEG-A1-20的HPLC色譜圖（在AMA溶液中脫保護2小時，然後用磷酸鹽緩衝液稀釋）描繪了在整個合成過程中出現的少量寡聚A雜質（圖4d）。類似於4臂PEG-T20的合成，寡聚A雜質的量很小，直到15個核苷酸為止，並在最後一步增加。

圖4.透過重複20次的OP-LPOS從4臂PEG-OH合成4臂PEG-A20。

4臂PEG-DNA模型網路

透過高質量和大規模地獲得4臂PEG-T20和4臂PEG-A20，作者證明了這種結構單元在互補結構單元的DNA雙鏈雜交交聯的超分子模型網路水凝膠中的應用（圖 5a）。由於具有定義的網路拓撲，由A-B功能性4臂構件構建的超分子網路提供了對鍵動力學的獨特見解。由互補的DNA序列構成的水凝膠還可以使網路融化和冷卻，從而透過缺陷退火確保理想的拓撲結構。水凝膠（幾釐米3的碎片）可以熔化並倒入各種形狀，而在室溫下沒有可見的流動（圖5b）。流變儀中f = 1 Hz處的溫度掃描顯示在44°C下儲能模量G'和損耗模量G''的交叉（圖5c），這與凝膠到溶膠的轉變相對應。

圖5.由4-臂PEG-T20和-A20構建單元形成的模型網路水凝膠。

參考文獻：doi.org/10.1021/jacs.0c05488