剛剛（2021年1月19日）在Cell Research上線了一篇文章，Direct control of store-operated calcium channels by ultrafast laser，我們實現了用鐳射直接特異性地控制細胞SOC鈣離子通道，而不需要光遺傳技術。我們給出了完整的分子機制，以及在多個細胞系和在體水平上（不開顱的活體小鼠大腦的神經元）上實現了調控。這個工作實驗上做了四年多，發表拖了兩年，過程極其坎坷艱辛，記錄如下。

這篇文章是我的學生程攀和田曉瑩為核心做的。最開始是程攀剛剛本科畢設的時候，在我這裡做了一些簡單的預實驗，主要是用飛秒鐳射刺激細胞，看鈣訊號的變化。那時我剛開始在交大建實驗室，其實就是在測試系統性能，我想著本科生畢設刷一篇BOE或者APL也挺酷炫，就設計了一個套路化的思路讓他去做，很快拿到了一些簡單的資料。我注意到細胞的鈣上升對飛秒光的波長極其敏感，當時他在700，800，和1000 nm各測了一組點，同樣的鈣內流需要鐳射的功率相差達到20倍以上。我非常驚訝，讓他進一步測整個700-1000 nm的光譜。為了保證資料公平可靠，每次測量前我們都要對系統和細胞進行工程上的calibration，整個過程異常枯燥瑣碎，程攀也多次抱怨，不過好在他堅持了下來。

當整個光譜（就是最後的Fig. 2a）展現出來的時候，我知道事情一定很複雜，細胞對鐳射波長的敏感性達到了令人震驚的程度，這絕不是一個簡單的多光子激發過程——它對波長不敏感，而是有某個分子參與其中。我當時想不到會是離子通道，而是猜測是細胞內的某個分子。由於光譜（其實是個殘缺的譜，700 nm以下的資料至今也沒有拿到）峰值在700 nm，對應的雙光子吸收特徵分子最可能的是NADH。我請教了學院的NADH專家殷老師，他猜測線粒體-ROS會是主因。我心中異常失望，因為這是一個非常無趣且沒用的機制。我讓程攀測量了線粒體的膜電位、ROS等所有指標，並使用了一大堆ROS的scavenger，結果再次出乎意料，線粒體的指標在整個鈣內流過程中沒有變化，mitoROS也沒有變化。實驗走上了死路，但也意味著新的機會。

然而我和殷老師合作的時候，幫他測到了一個面板自熒光的現象，在分析資料的時候，我查了大量的分子光譜的論文，發現flavin在700-800 nm波段具有非常好的雙光子吸收峰。那麼會不會是flavin？為了驗證這個思路，我設計了一個當時感覺非常精巧後來看來比較低效率的實驗，就是在雙光子激發後測量flavin的自熒光變化。這次猜對了，鐳射激發區域的flavin自熒光出現了顯著性下降，而且鐳射激發鈣內流的效率與細胞本身的flavin水平呈現極高的相關性。當然，我當時是思路依然繞著線粒體在打轉轉。於是我們立刻去費了很大勁調了細胞的flavin水平，包括用RNA調節FAD的酶，使用RF以及FAD培養細胞等。結果顯示，flavin非常重要。

然而，這些結果卻一直和線粒體-ROS沒有什麼關聯。我們做了一個精細的觀測鈣內流的實驗，並且用了一大堆各種熒光蛋白去visualize鈣內流在各個亞細胞結構中傳播的過程，發現這個過程是從細胞膜上開始了。所以是離子通道？

整個鈣內流的過程是緩慢的，最疑似的莫過於SOC通道，當然還有TRP通道。程攀爭辯說並不能排除細胞內的諸如RYR，細胞膜上的P2X，P2Y等。好在驗證SOC是我的老本行，我們篩選了一大堆離子通道抑制劑，做了TRP和TRPC的排除，做了經典的add back實驗，並用siRNA調了Orai1的水平。這些結果讓我心中已經九成相信，就是SOC。

於是整個實驗過程中最困難的一步來了，鈣內流光譜和flavin相關，鈣內流過程與SOC相關，flavin和SOC是八竿子打不著的東西啊，這tmd是啥原因。我們整天都在苦苦查論文尋找靈感，我作為一名極度悲觀主義者，程攀更是，我們一度自我懷疑我們的資料有問題。

就在打算放棄了開始寫論文投個BOE的時候，一個轉機出現了。程攀告訴我，他剛剛聽了一個報告，Leica公司邀請了中科大的鮑進老師講雙光子系統，他會後找鮑老師聊天，發現他們那兒有這個系統。我立刻聯絡了鮑老師，問能否到他們那裡做個實驗，鮑老師和我討論了一些細節之後就答應了，我又進一步聯絡了他們實驗室主任也是中科大生科院院長，我的校友學長薛天教授。薛老師也很nice地答應沒問題。

既然要過去，只做一個實驗價效比不足，我又查了薛老師的工作，發現他們那裡還可以看腦片，於是又設計了一個in vivo的demo實驗，鮑老師說沒問題。我帶著程攀去了合肥，住在科大西區門口的一個破賓館裡。這是我本科畢業十年後第一次回母校，沒想到是去做實驗的。

在過去的路上，我們依然在討論可能的機制，到科大的時候已經是晚上，我和鮑老師約好第二天一早去實驗室。我帶程攀吃了我記憶中的小馬燒烤，感覺味道下降了很多，但他作為一個上海讀書的土包子，依然震驚於味道居然這麼好。吃過飯，我們各自回房間查文獻。我依然記得那天晚上，凌晨一點多，程攀問我，賀老師睡了嗎？我說沒有。他說那你來我房間一下，我有重大發現。

在科大做實驗非常不順利，一方面是在別人的實驗室肯定什麼都是不順手的，一方面膜片鉗我們都不會，難度也非常大。鮑老師親自上陣也沒解決。我第二天還有課，就先回了上海，留下程攀繼續享受實驗和合肥的美食。

在鮑老師和薛老師的支援下，我們最終只拿到了一點點膜片鉗的資料，不完整。但我們幸運地拿到了腦片的資料，也就是說，我們這個技術是可以在在體水平上工作的。我又讓程攀做了活體小鼠的結果，沒想到效果也是出人意料的好。

這時時間已經過去了兩年多，程攀處於碩士畢業的階段。我就先把整個資料整理完，寫了一篇機制上很不完備的論文。我覺得這個工作的核心在於我們第一次發現了鐳射是可以直接控制SOC通道的，可以利用細胞內源性的flavin作為感光基團。我把論文發給了science的編輯和nature biotech的編輯看。他們都給了很好的評價，於是我就匆匆投了nature biotech，我的dream journal，當時我還數了一下，整個中國大陸以第一單位在nature biotech上發的論文不超過10篇。

論文很快送審，那是2017年的暑假，我極度開心，但也非常忐忑，我知道整個工作非常粗糙，漏洞百出，沒有完整的機制，通篇都是推測，也缺少應用上的驗證。

2017年10月，我在給本科生上課前收到了nature biotech的郵件，拒稿，但建議修改後重投。四個審稿人，審稿意見寫了11頁，只有一個人給了很高的評價，建議補一些小實驗，有一個人建議大修，一個人建議把機制做完整，還有一個人沒有看懂，長篇大論說這個肯定是ROS的機制。我看得非常生氣，那天整個上課的時候都魂不守舍，手都在發抖。

接下來我和學生們認真地把意見一條一條過，一條一條設計實驗，基本上除了一個加強在體應用的建議以外，其它的意見我們感覺都可以透過實驗論證。我又有點開心，先大致寫了一個迴應給編輯，問他我們大概這樣修行不行，編輯簡單地說，加油，我期待看到你們的修改。

我們最核心的機制基本就是在這個階段完成的，特別是最重要的flavin與Cys結合是否透過thioether bond，以及Orai1透過疏水鍵結合等等。為了應付所謂應用，我們做了一個很糙的demo，用拮抗劑抑制了腦片的神經元，然後用鐳射開啟。這個實驗其實也很糙的，但我當時沉醉於做出了一種不需要光遺傳的光遺傳工作的美夢中，沒想太多。

論文改完，已經是2018年底，投回去沒多久，另外幾個審稿人表示問題不大了，但之前那個負面審稿人依然沒有被說服，編輯還說你們怎麼沒有做動物行為學的技術驗證呢？再次拒稿。我非常不服，appeal了一次，還是被拒了。當時心中極其不爽，然後轉投了nature methods，很快送審了。我心中再次充斥了希望。

然後到了2019年過年之後，nature methods意見出來了， 也是四個審稿人，兩個人給了很好的意見，都是推薦發表，其中一個給的意見非常有建設性，他建議我們分別把三個Orai1上的Cys突變掉，這樣就能篩選出來flavin究竟是和哪個Cys結合的。一個人給了一些修改意見，比較簡單，一個人給了四條意見，刀刀見血，分別是，沒有膜片鉗，沒有行為學，沒有與光遺傳的技術比較，沒有通道唯一性的證明。編輯出人意料的拒稿，我不服，appeal，再被據。

我心中已經充滿了絕望。當時程攀已經在學校待到了最後一刻，即將去紐約大學醫學院讀博。我對審稿意見還是很佩服的，就讓第二個學生田曉瑩接手。為了針對審稿意見做實驗，我們需要搞到Orai1-KO的細胞。我查論文的時候看到北大的陳良怡教授之前也做過很多Orai1的工作，就抱著一絲希望問他有沒有，他說北師大的王友軍教授那邊有。我聯絡了王老師，拿到了至關重要的Orai1-KO和Orai1,2,3-KO的HEK293細胞。為了保險，我們也構建了相應的HeLa細胞。我們在這些細胞上做了Orai1-KO和rescue實驗，以及Cys三突變實驗，找到了flavin是和C195和C143結合。此外我們也做了FRET實驗，直接證明了Orai1在鐳射啟用後確實是形成了分子鍵結合。到了這一步，機制上已經非常完備了，唯一的短板還是應用。

我抱著希望投回了nature methods，但編輯沒有送審，於是我又轉投nature photonics，沒想到送審了，很快三個審稿人回來，兩個推薦發表，一個給了一點小意見，但編輯居然拒稿了。我完全不懂為啥，編輯說這個工作太過於生物，建議你投NCB。我心情已經糟到了極處，又投了NCB，這個太難，畢竟是僅次於cell的大刊，不會理我們這種做方法的。果不其然，論文都沒送審就被拒了。

我覺得是不是我寫得不好，於是就把論文發給了我的老朋友，東大的Goda教授。他把我批了一頓，說這個文章要是一早給他來改，絕對早就發了。我們寫得太差。於是在2020年疫情最嚴重的那幾個月，Goda給我改了一輪又一輪的論文，然後他建議我投science advances，畢竟被N系雜誌拒得滿頭包，新系統新氣象。

投給sci adv我是很不爽的，它在我心中是和NC差不多的“水刊”，論文質量良莠不齊。我心中帶著鄙夷投過去，很快送審，但沒想到就很快又被拒。我看了審稿意見，基本沒怎麼讀我們的文章，如果寫response letter，基本就是給審稿人做科普和反駁。我心中極其不滿，寫信給編輯把審稿人罵了一頓，我倆在email裡來回吵架。

至此我已經感到心力交瘁，Goda教授讓我趕緊投PNAS。我因為還想著用這篇文章來爭取專案，想搞個快的，於是不聽他的，把整個nature biotech， nature methods，和nature phtonics的審稿意見以及response letter發給了cell research的編輯李黨生教授，問他有沒有可能快速送審快速決定。我記得他以前和我說過，可以這樣操作。李博士非常認真地讀完所有材料和我們的論文，我知道這個是因為他回信的時候還和我羅列了一堆論文裡的一些小錯誤，和我寫的response letter裡不對的地方（這一點讓我在最黑暗的時刻感到很溫暖），和我說可以給我快速送審。於是很快論文送審，四個審稿人，三個建議接收，一個提了一些簡單的意見，主要還是關於Orai1上的蛋白，不一定是C，也可能是L。於是我們又補了這麼一個實驗，論文終於被接收。Goda還和我說，這個雜誌不好，是你們中國人的自high，還是PNAS好。我說PNAS不過是美國佬的自high，我看好國產期刊。

這篇論文接收後很幸運，我收到了優青的答辯通知，也用上了這篇文章，算是得到了利益最大化。尤其幸運的是，國家真的出臺了一大堆政策，來鼓勵發國產期刊。我以此聊以自慰，發CR總比發NC強。這是一個功利的結局，但並不違揹我的初心。

整個工作過程歷時四年多，投搞折騰了一兩年。這對我的鍛鍊非常大。之前投NP的時候似乎過於順利，我並沒有得到很多成長。最近在寫論文和設計思路的時候，確實明顯感受到遊刃有餘。希望後面的這幾篇文章能順利一些，也希望我們的國產期刊能擺脫中國人自high的陰影，早日成長起來。

文章連結：

https://www.nature.com/articles/s41422-020-00463-9