撰文 | 十一月
責編 | Qi
超解析度顯微鏡逐漸成為生物學研究中有力的工具，但是獲取大量不同目標樣品的多路影象仍然具有挑戰性。在這種情況下，DNA-PAINT技術（DNA point accumulation in nanoscale topography）【1】應運而生。DNA-PAINT技術是指透過短熒游標記的寡核苷酸用於奈米級定位成像的點積累短暫結合，可以在固定細胞內實現簡單且易於實現的多路3D超解析度成像並可以在體外實現奈米級別的空間解析度【1】。但是DNA-PAINT技術存在一定的技術性限制，由於細胞核內的靶標與探針的DNA-DNA的雜交會造成訊號背景較高。
近日，來自德國柏林自由大學H. Ewers 研究組在Nature Biotechnology雜誌上發表了一篇題為“Left-handed DNA-PAINT for improved super-resolution imaging in the nucleus”的文章，建立了新穎的左手螺旋DNA-PAINT技術（L-DNA-PAINT），對先前的DNA-PAINT技術進行了進一步的最佳化，大大提高了該技術的解析度以及超分辨成像中的多路複用能力。
超解析度顯微鏡技術提高了人們對於細胞內結構細微之處的認識。單分子定位超解析度顯微鏡（Single-molecule localization super-resolution microscopy，SMLM）透過每次幾個分子的連續成像來實現對單分子奈米級解析度的記錄【2, 3】。DNA-PAINT技術是透過DNA雜交進行的，使用明亮的、光穩定的有機染料來獲得最大的單分子定位解析度。然而，任何的DNA分子在統計的平均值來說有22000個互補結合位點，這可能會導致DNA-PAINT技術的假陽性的出現。此外，轉錄組中也會出現不必要的DNA-RNA雜交。為了克服這一問題，作者們使用了左手螺旋的L-DNA來最佳化DNA-PAINT技術。L-DNA的物理化學性質與R-DNA基本相同，但是L-DNA在自然情況下不存在且不會與R-DNA之間雜交【3, 4】（圖1a-b）。
圖1. L-DNA-PAINT與傳統R-DNA-PAINT的比較
首先，作者們對L-DNA-PAINT技術的表現進行了檢驗。作者們將HeLa細胞中的微管結構作為檢驗的平臺，實驗發現無論是R-DNA-PAINT還是L-DNA-PAINT技術都能夠精準地表現出微管的中空結構（圖1c），並且兩者的分析解析度均能夠達到33-39nm左右。因此，作者們認為L-DNA-PAINT技術與R-DNA-PAINT技術在解析度方面表現相似。進一步地，作者們對兩種技術對基因組DNA的雜交潛力進行檢測。作者們發現，與R-DNA-PAINT技術相比，L-DNA-PAINT中細胞核中的定位降低到細胞質中的背景水平。另外，作者們對兩種技術的假陽性情況進行了檢測。透過BrdU（非天然核苷酸）整合到DNA複製位點的實驗，作者們發現L-DNA-PAINT實驗中可以對特定的複製中心進行精準標記。
DNA-PAINT技術一個重要的亮點是可以對多個目標位點進行視覺化研究。透過使用不同的L-DNA成像結合子（Imager-binder pairs）對PCNA以及Ki67進行染色，作者們發現兩種分子都可以被染色，並且與先前報道的在細胞核內的定位類似【5】。
總的來說，作者們所建立的最佳化版L-DNA-PAINT技術具有與傳統R-DNA-PAINT相同的特異性、解析度以及多路複用的能力，但R-DNA-PAINT技術相比具有更低的假陽性率以及更低的背景。未來，L-DNA-PAINT技術作為單分子定位超解析度顯微鏡技術的重要實驗方法能夠更加精細地在奈米級別解析度上視覺化以及定量化DNA相關的分子，為進一步地對細胞內的結構進行解析提供了“更優解”。
原文連結https://doi.org/10.1038/s41587-020-00753-y
製版人：琪醬
參考文獻
1. Jungmann,R. et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT andExchange-PAINT. Nature methods 11, 313-318, doi:10.1038/nmeth.2835 (2014).
2. Rust, M. J., Bates, M.& Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic opticalreconstruction microscopy (STORM). Nature methods 3, 793-795,doi:10.1038/nmeth929 (2006).
3. Betzig, E. et al.Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science(New York, N.Y.) 313, 1642-1645, doi:10.1126/science.1127344 (2006).
4. Hauser, N. C. et al.Utilising the left-helical conformation of L-DNA for analysing different markertypes on a single universal microarray platform.Nucleic acids research 34,5101-5111, doi:10.1093/nar/gkl671 (2006).
5. Chagin, V. O. et al. 4DVisualization of replication foci in mammalian cells corresponding toindividual replicons. Nature communications 7, 11231, doi:10.1038/ncomms11231(2016).