撰文 | Qi

責編 | 兮

肌萎縮側索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）和額顳葉痴呆（frontotemporal dementia, FTD）是兩種常見的神經退行性疾病。兩者存在類似的病理特徵，如RNA結合蛋白TDP-43在受累個體的大腦和脊髓中聚集【1】，此外，C9orf72基因GGGGCC重複序列擴增也是兩者共同的遺傳致病因素。含有重複序列的RNA可以翻譯成二肽重複序列（dipeptide repeat, DPR）蛋白質，例如甘氨酸-丙氨酸（GA）、脯氨酸-精氨酸（PR）等，能夠在C9orf72突變患者的大腦中積累，產生細胞毒性，富含精氨酸的GR和PR毒性最強【2, 3】。但令人困惑的是，這兩種毒性最強的DPR在患者腦中的含量竟不如其他型別，其中緣由仍不為所知。

2021年1月21日，來自美國斯坦福大學醫學院的Aaron D. Gitler和Maya Maor-Nof在Cell雜誌上合作發表了一篇題為p53 is a central regulator driving neurodegeneration caused by C9orf72 poly(PR) 的文章，在這項研究中，作者克服先前的技術困難，開發一種作用於原代神經元的改良型ATAC-seq，揭示了p53在poly(PR)誘導的神經退行性變中發揮的意想不到的作用，並提供了一個將ATAC-seq應用於神經元來定義神經退行性變機制的範例。

C9orf72六核苷酸重複序列擴增產生的兩種ALS相關蛋白TDP-43和poly(PR)均能形成聚集體並導致變性，那麼二者是透過相似還是不同的機制實現的呢？首先，作者構建了一個體外系統，用於監測由poly(PR)或TDP-43累積引起的神經元死亡和軸突變性。具體而言，作者將小鼠原代腦皮層神經元在體外培養，轉以分別表達 (PR)50、TDP-43或GFP的慢病毒，在72h左右觀察到軸突變性，神經元死亡等現象。進一步地，作者分別在不同時間點收集神經元並提取DNA和RNA，以完成後續的ATAC-seq和RNA-seq。作者發現，儘管TDP-43累積誘導的神經退行性變似乎涉及由多種轉錄因子介導的不同調控元件的啟用，但對C9orf72(PR)50的反應卻對富集於p53結合位點的調控元件具有顯著特異性。與此一致的是，RNA-seq結果顯示差異表達的基因中，最明顯上調的基因例如Cdkn1a、Puma等都是p53靶基因，相反，表達TDP-43的神經元中的轉錄程式與p53沒有明顯關聯。此外，對三種神經元裂解液的免疫印跡結果也顯示，p53蛋白水平在(PR)50神經元中顯著升高。這些結果提示，p53可能是C9orf72(PR)50引起神經退行性變的一箇中心調節因子。

為了進一步證實這一發現，作者對p53- KO和p53-WT小鼠的原代神經元轉以表達TDP-43或(PR)50的慢病毒。與預期一致，p53-KO神經元完全免受(PR)50而非TDP-43引起的神經變性的影響，且這種保護是永續性的。那麼p53敲除是否也能在體內提供這種保護呢？為此，作者使用腺相關病毒載體構建的轉基因小鼠模型，在小鼠大腦中表達C9orf72(PR)50，並觀察這些小鼠的存活情況（見圖1）。結果顯示p53敲除足以延長C9orf72(PR)50引起的神經退行性變小鼠模型的存活時間，當然，需要注意的是相對於p53-HET小鼠和WT小鼠而言，p53-KO小鼠高度易患惡性腫瘤。

圖1. 實驗設計示意圖

除此之外，作者觀察到與野生型小鼠相比，p53-KO小鼠的皮層和海馬中表達(PR)50的細胞數量顯著增加，(PR)50能夠在p53-KO小鼠的大腦中積累到高水平可能是由於對其毒性存在抵抗性。這一發現可能有助於解釋開頭提出的問題，為什麼在人類死後樣本中poly(PR)水平很低？poly(PR)的強毒性除非透過例如p53抑制的方式加以阻斷，否則無法累積到高水平。

為了研究p53是否參與人類模型中C9orf72-GGGGCC重複擴增的發病機制，作使用了來自C9orf72-ALS患者的iPSC，且在iPSC分化的運動神經元中發現DNA損傷增加。在使用shRNA部分減少p53後可觀察到DNA損傷程度減輕，提示p53在C9orf72陽性神經元中被啟用，誘導DNA損傷和細胞凋亡機制。

最後，在確認p53被C9orf72-DPRs的表達啟用，進而導致p53依賴性轉錄程式的啟用，並最終引起神經退行性變之後，作者進一步研究了p53介導(PR)50毒性的下游機制。在小鼠原代神經元模型中，(PR)50表達40小時後，週期依賴性激酶抑制劑1A（Cdkn1a）和p53正向凋亡調節因子（Puma）水平顯著上調，且Puma轉錄起始位點附近富集ATAC-seq峰，結合Puma在外周神經系統發育過程中對軸突的關鍵作用及其在介導p53誘導的細胞死亡中的作用【4, 5】，作者使用siRNA降低Puma水平後能顯著延遲C9orf72(PR)50引起的軸突變性，完全敲除Puma，即使(PR)50表達120小時後，這些神經元也未出現軸突斷裂。總之，這些資料證明Puma至少是參C9orf72(PR)50誘導的軸突變性和細胞死亡的關鍵下游p53靶點之一。

總的來說，這項研究透過ATAC-seq在原代神經元中的應用，並結合小鼠模型和臨床患者來源的iPSC實驗資料，揭示了p53在C9orf72(PR)50誘導的神經元退行性變中的作用。然而，C9orf72(PR)50透過何種方式如何啟用p53？以及p53作為腫瘤抑制因子，將其作為ALS的治療靶點是否合理？這些都是未來研究需要解決的問題。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.025

製版人：十一

參考文獻

1. Neumann, M., Sampathu, D.M., Kwong, L.K., Truax, A.C., Micsenyi, M.C., Chou, T.T., Bruce, J., Schuck, T., Grossman, M., Clark, C.M., et al. (2006). Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science314, 130–133.

2. Gitler, A.D., and Tsuiji, H. (2016). There has been an awakening: emerging mechanisms of C9orf72 mutations in FTD/ALS. Brain Res. 1647, 19–29.

3. Kwon, I., Xiang, S., Kato, M., Wu, L., Theodoropoulos, P., Wang, T., Kim, J., Yun, J., Xie, Y., and McKnight, S.L. (2014). Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science 345, 1139–1145.

4. Maor-Nof, M., Romi, E., Sar Shalom, H., Ulisse, V., Raanan, C., Nof, A., Leshkowitz, D., Lang, R., and Yaron, A. (2016). Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron 92, 991–1006.

5. Han, J., Flemington, C., Houghton, A.B., Gu, Z., Zambetti, G.P., Lutz, R.J., Zhu, L., and Chittenden, T. (2001). Expression of bbc3, a pro-apoptotic BH3-only gene, is regulated by diverse cell death and survival signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11318–11323.