江蘇鐳射聯盟導讀：
據悉，來自慕尼黑大學(LMU)和阿根廷布宜諾斯艾利斯大學的研究人員簡化了MINFLUX顯微鏡，併成功地區分了非常相近的分子並跟蹤其動態。該研究成果2021年12月18日發表在ACS Publications上。
在此幾年前，光學顯微鏡中一個已知的基本解析度極限被突破了，這一突破在2014年獲得了超解析度顯微鏡諾貝爾化學獎。從那時起，該領域又發生了一次本質上的飛躍，這進一步將解析度極限降低到了分子水平(1 nm)。瑞典皇家科學院將2014年諾貝爾化學獎授予兩名美國科學家和一名德國科學家。分別為美國科學家埃裡克·白茲格(Eric Betzig)，德國科學家斯特凡·W·赫爾(Stefan W. Hell)，美國科學家威廉姆·艾斯科·莫爾納爾(William E. Moerner)， 以表彰他們在超解析度熒光顯微技術領域取得的成績 。
▲左：埃裡克·白茲格，美國人，霍華德·休斯醫學研究所的研究帶頭人。1960年生於美國密歇根州安娜堡，1988年獲得美國康奈爾大學博士學位。中：斯特凡·W·赫爾，德國人，哥廷根馬克斯普朗克生物物理化學研究所的主任，海德堡德國癌症研究中心的部門主任。1962年生於羅馬尼亞阿拉德，1990年獲得德國海德堡大學博士學位。右：W·E·莫爾納爾，美國人，美國斯坦福大學應用物理系和化學系教授。1953年生於美國加州普利桑屯，1982年獲得美國康奈爾大學博士學位。
超解析度熒光顯微技術(Super-resolution fluorescence microscopy)也稱為遠場熒光奈米顯微技術，這項顯微技術徹底改變了生物成像技術，因為它保留了熒光顯微技術的優勢，同時提供了亞衍射，理論上不受限制的空間解析度。第一代超解析度方法，包括掃描方法，例如STED(受激發射損耗, stimulated emission depletion)，和廣域單分子定位顯微鏡(SMLM)方法，例如STORM和PALM，通常達到橫向解析度20-50nm的波長，受熒光團光穩定性的限制。在60-120 nm範圍內，軸向解析度通常會差2到3倍。最近，DNA-PAINT達到了小於10 nm的橫向解析度，部分克服了這一侷限。具有這種解析度水平的成像已經能夠表徵其自然狀態下的亞細胞結構、奈米解析度的環境以及超分子蛋白質結構。儘管如此，要達到熒光顯微鏡的最終解析度，即熒游標記物的分子大小，還需要進一步提高解析度極限。這是透過使用一種稱為MINFLUX（最小發射FLUXes）的技術來實現的，一種結合結構化照明和單分子定位以最小的光子數提取單個分子的最大位置資訊的新策略。MINFLUX可以在單個分子的成像和跟蹤中常規提供約1 nm的定位精度。它已在模型系統（DNA摺紙結構），固定和活細胞，中得到證明，並且最近擴充套件到三個維度。雖然MINFLUX代表了一項突破，但其由於其實驗實施的技術複雜性高，因此減緩了廣泛使用的速度。
在這裡，研究人員介紹了脈衝交錯式MINFLUX（p-MINFLUX），這是MINFLUX的一種新穎的實驗實現，僅透過調整激勵就可以在配備有時間相關單光子計數（TCSPC）檢測的現有共焦顯微鏡中實現，不需要快速掃描光學器件或現場可程式設計門陣列（FPGA）電子器件。此外，與原始的MINFLUX相比，p-MINFLUX具有訪問激發態壽命資訊的附加優勢，這是單分子光譜學中的一個相關引數，因為它可以實現單色測量的多路複用並提供有關熒光團環境及其與其他分子或材料的相互作用的資訊。
圖1. p-MINFLUX概念和實驗系統的描述。
▲圖解：（A）四個脈衝交錯的甜甜圈形光束聚焦在以三角形圖案排列的樣品上，第四個光束位於三角形的中心。每個脈衝的到達時間表示為τi。位於鐳射光斑位置之間的單個熒光分子的位置由星號表示。（B）p-MINFLUX設定的示意圖，詳細說明了用於產生延遲了Δt的脈衝交錯甜甜圈焦點的激勵路徑。（C）在原始鐳射源的一個週期（T）內檢測到的光子計數的示意圖訊號。
Philip Tinnefeld教授（LMU）和Fernando Stefani教授（布宜諾斯艾利斯大學）領導的研究團隊及時地插入了鐳射脈衝，以便它們可以以最大可能的速度在焦點位置之間切換。另外，透過使用快速電子裝置，獲得了皮秒範圍內的時間解析度，這對應於分子內的電子躍遷。換句話說，顯微鏡的極限僅取決於所用染料的熒光特性。
▲常規共聚焦顯微鏡（大）和使用p-MINFLUX的染料的熒光壽命
在該文中，科學家成功地證明了新的p-MINFLUX方法可以實現熒光壽命的區域性分佈（這是表徵染料環境的最重要的測量變數），解析度為1 nm。Philip Tinnefeld解釋說：“使用p-MINFLUX，有可能在分子水平上揭示結構和動力學，這對於我們理解直至生物分子反應的能量轉移過程至關重要。”
該專案由德國研究基金會（卓越電子轉換叢集，SFB1032），科學技術研究委員會（CONICET）和阿根廷國家研究，技術發展與創新機構（ANPCYT）資助。Stefani教授是亞歷山大·馮·洪堡基金會（Alexander von Humboldt Foundation）的喬治·福斯特（Georg Forster）獎獲得者，並擔任慕尼黑LMU物理化學的定期客座科學家。