腸道菌群的研究很火熱，但很多結果都是自說自話，甚至經常“打架”，我們要習慣這種情況，畢竟技術不是完美的，實驗設計也不是完美的，實驗執行也不是完美的，科研態度也不是完美的，最後得到的結果就不可能完美，如果真的出現了完美的結果，那大機率是修飾後的結果。

（1）姑且認為提取這個環節沒有出問題，那麼PCR環節就來問題了，PCR引物的設計會導致偏好性，某些菌擴增的效率偏高，某些菌擴增的效率偏低，還有一些菌就直接遺漏掉了。

（2）PCR過程是一個放大的過程，引物設計會導致結果的偏離，PCR放大的過程不一致，也會導致結果的偏差。

（3）我們進入到更細微的層面：16S rRNA基因在細菌的基因組中存在多個複製，不同屬的16S rRNA基因複製數不同，同一個屬內有些種的16S rRNA基因複製數相同，有些種則不同，更詳細到菌株的層面，即使同一個種內某些株的16SrRNA基因複製數也存在差別，這樣就導致我們基於16S rRNA基因可變區測序預估的腸道菌群物種組成比例只能是對應分類的16S rRNA基因數的相對比例，並不是該分類對應的真實的細胞數目的比例，內容來源於《16S rRNA可變區測的問題》。

（4）某一個菌株含有多個16S rRNA基因複製，這些複製的序列也並不一定完全相同（細菌基因組中的16S rRNA基因複製是完全一樣的嗎？），這樣就導致擴增的效率不同（16S高通量測序引物選擇對菌株比例的影響），也就是說你無法判定該菌株的16S rRNA基因的多個複製真實的擴增情況。

有這些問題，但為啥16S rRNA測序還是用的很多，原因可能是沒有更好的技術補充，再就是這個價格真的低。