Mol Plant 背靠背 | 多個課題組合作揭示CPSF30-L介導m6A甲基化調控氮素代謝的作用及分子機理

2021年1月27日, Molecular Plant線上發表了南方科技大學李思思課題組、中國科學院遺傳與發育生物學研究所曹曉風課題組和山東農業大學王勇課題組合作完成的研究論文“CPSF30-L-mediated recognition of mRNA m6A modification controls alternative polyadenylation of nitrate signaling-related gene transcripts in Arabidopsis”。該研究在模式植物擬南芥中發現了既具有mRNA 上化學修飾N6-甲基腺嘌呤(m6A)識別功能又參與mRNA 3'末端加工的CPSF30-L蛋白透過識別mRNA 上m6A修飾來調控mRNA的poly(A)位點選擇影響硝態氮訊號相關基因的表達從而調控植物氮吸收和同化的新機制。

m6A是真核生物mRNA上最豐富的一種化學修飾，參與多種重要的生命活動。m6A修飾的識別蛋白主要是一類含有YTH結構域的蛋白家族成員，然而對此類蛋白的結構和功能研究主要集在哺乳動物中，其他物種如擬南芥中YTH結合家族蛋白的研究相對較少。此外，已有研究表明m6A主要透過參與調控mRNA的定位、剪接、降解以及翻譯等代謝過程來影響基因的表達，但是關於m6A修飾對pre-mRNA 3'末端poly(A)位點選擇影響的研究尚為數不多。

選擇性多聚腺苷酸化 (Alternative polyadenylation, APA) 是一種在多物種內廣泛存在、重要的轉錄後基因表達調控機制，受到pre-mRNA 3'末端加工複合體精準而動態的調節，其中CPSF30是3'末端加工複合體的重要組成成員。擬南芥中CPSF30基因經APA調控後編碼產生兩種大小不同的蛋白：CPSF30-S和CPSF30-L蛋白，CPSF30-L蛋白在其碳端存在一個植物中所獨有的YTH結構域。先前研究表明只有CPSF30-L蛋白可以回補突變體硝酸吸收缺陷的表型，暗示YTH結構域對CPSF30-L生物學功能的重要性。同時推測m6A修飾可能參與了氮素吸收的調控，但具體機制尚不清楚。提高作物對氮素的有效利用率，對於農業的高產高效和減少氮素的面源汙染意義重大。因此，加強對氮素吸收調控基因及其分子機理的研究具有重要的農業生產應用價值。

該研究首先利用體外生化實驗證明了CPSF30-L的YTH結構域可以優先結合帶有m6A修飾的RNA，同時解析了CPSF30-L的YTH結構域結合m6A RNA的複合物結構，獲得了參與m6A修飾識別的關鍵氨基酸位點資訊（如：W259，W310和Y319）；對帶有m6A修飾的基因與poly(A)位點的選擇受到CPSF30調控的基因關聯分析，發現存在m6A修飾的基因在CPSF30突變體中更容易發生APA；進一步的分析表明參與氮代謝的一些關鍵基因都帶有m6A修飾且在cpsf30-2突變體以及m6A識別位點突變回補株系（W259A，W310A和Y319A）中發生了poly(A)位點的選擇變化，並導致了表達量的改變；更重要的是生理實驗表明m6A識別位點突變回補株系存在硝態氮代謝缺陷的表型，暗示了YTH結構域功能的重要性。

綜上所述，該研究闡明瞭CPSF30-L介導的m6A甲基化修飾的識別透過參與APA調控進而影響植物氮素代謝的作用及其分子機理，從而為改良作物品種、提高作物對氮素的利用率提供了理論支撐。

中科院遺傳所博士後侯毅楓、助理研究員孫婧和原南方科技大學博士後吳柏星（現中山大學副研究員）以及山東農業大學博士後高陽陽為共同第一作者；南方科技大學李思思研究副教授、中科院遺傳所曹曉風研究員和山東農業大學王勇教授為共同通訊作者。

值得一提的是，Molecular Plant 同一時期線上發表了來自北京大學賈桂芳課題組題為“Arabidopsis N6-methyladenosine reader CPSF30-L recognizes FUE signal to control polyadenylation site choice in liquid-like nuclear body”的研究論文。該研究發現，CPSF30-L可以發生相分離並且識別mRNA上poly(A)位點訊號序列FUE元件調控APA，進而影響植物的開花時間和對ABA的響應，從不同角度進一步證實了CPSF30-L作為m6A修飾的識別蛋白透過調控APA參與植物生長髮育及環境應答的重要功能。

該研究鑑定出擬南芥中YTH結構域蛋白CPSF30-L為m6A的結合蛋白，並且發現CPSF30-L可以透過m6A的結合能力影響擬南芥的開花以及ABA響應。亞細胞定位以及FRAP實驗表明CPSF30-L蛋白分佈於細胞核中併發生液液相分離形成核體結構，透過體內實驗證明CPSF30-L的m6A結合功能可以促進相分離的核體形成。利用該課題組之前開發的甲醛交聯-免疫共沉澱(Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技術，在全轉錄組水平上鑑定了CPSF30-L-RNA相互作用位點，揭示了CPSF30-L主要結合mRNA的3'非翻譯區 (3'UTR), 並且傾向於結合保守m6A基序以及聚腺苷酸化訊號—UGUA、GAAMH、AAUAAA，暗示CPSF30-L透過識別m6A修飾的聚腺苷酸化訊號調控pre-mRNA 3'末端的加工過程。

為了進一步驗證m6A結合蛋白CPSF30-L在聚腺苷酸化中的調控功能，作者對野生型和CPSF30-L的T-DNA插入突變體cpsf30-l進行poly(A)位點測序分析，發現CPSF30-L的破壞會整體影響poly（A）位點的偏移，進一步的分析證實，CPSF30-L透過識別 m6A修飾的FUE聚腺苷酸化訊號進而精密控制poly（A）位點的選擇。進一步機理研究發現影響擬南芥開花以及ABA響應的三個基因SOC1, RPN10 及FYVE1的轉錄本可以被m6A修飾且被CPSF30-L結合。相對於野生型而言，在cpsf30-l 中，SOC1, RPN10及FYVE1的pre-mRNA在3’UTR加工過程中更傾向於遠端poly(A)位點，導致3’UTR加長易被降解，相應mRNA表達量下降，繼而導致cpsf30-l突變體中呈現出晚花以及ABA響應敏感的表型（圖1）。這項研究發現了植物中m6A的全新功能—調控植物pre-mRNA聚腺苷酸化和植物相分離的分子機制。

北京大學化學與分子工程學院賈桂芳研究員為該論文的通訊作者，博士生宋培哲，博士後楊軍波為該論文的共同第一作者。

論文連結：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205221000149

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205221000137