阿爾茲海默症（Alzheimer's disease, AD）是人們熟知的一種神經退行性疾病，隨著社會老齡化程度加深，患病人數逐年增多。關於AD的假說很多，但其發病機制仍未解析清楚，也沒有一種有效的藥物治療手段，所以該領域仍然吸引著眾多研究者繼續對其進行探究。有許多研究發現，AD病人的神經元中的鈣訊號機制失常，STIM（stromal interaction molecule）蛋白表達量降低，STIM與質膜上Orai蛋白共同介導的鈣釋放啟用的鈣（Ca2+ release-activated Ca2+, CRAC）訊號也下調。CRAC訊號是動物細胞中普遍存在的一種重要鈣訊號產生機制，參與調控基因表達、生長增殖以及衰老死亡等眾多生物學過程，其功能的異常與多種疾病密切相關。因而，開發能操縱CRAC訊號的工具則具有非常重要的科學和醫學意義。光遺傳學技術具有時空特異性高、可逆性強及毒副作用小等優點，是操縱鈣訊號的新興方式。但目前的光遺傳學鈣工具存在著鈣選擇性低、非特異性靶點多、易產生副反應等缺點。美國德州農工大學Zhou Yubin教授實驗室與北京師範大學王友軍教授課題組在之前的研究中開發出了基於STIM的光控鈣工具Opto-CRAC。該工具能響應470nm藍光照射，發生結構改變並激活位於質膜上的特異性鈣離子通道ORAI。但Opto-CRAC誘導的鈣訊號依賴於細胞內源性ORAI蛋白量的表達，在沒有ORAI或者ORAI低水平表達的細胞及組織中使用具有侷限性。

Zhou Yubin教授實驗室與王友軍教授課題組聯合美國德州農工大學Huang Yun教授實驗室再次合作，經過5年多的不懈努力，於近日共同在Nature Communications 雜誌上發表文章，首次設計研發出一種藍光精準調控並激活的具有高度選擇性的鈣離子通道LOCa (light operated calcium channel)。LOCa是首個四次跨膜的光啟用通道，這是在光遺傳學領域的一個突破性的進展。研究團隊在細胞及個體水平上應用該工具，在不同方面均展現了光開關的LOCa對CRAC相關疾病的治療作用。

LOCa的主要設計思路是將光敏感蛋白與Orai蛋白結合。但Orai蛋白是一種四次跨膜的六聚體離子通道，直接對其進行改造具有非常大的難度。團隊經過多年努力，終於發現將光敏蛋白LOV2插入突變的Orai蛋白TM2與TM3之間的loop區，可以獲得最好的效果，保留Orai對鈣離子的高度選擇性的同時，實現對胞內鈣訊號的精準調控。

研究團隊進一步在細胞水平上，LOCa能夠有效抑制癌化造血幹細胞的異常自我更新，精準調控靶基因表達以及細胞壞死性凋亡（necroptosis）。個體水平上，研究人員在阿爾茲海默症(AD)果蠅模型中表達LOCa, 發現藍光照射後的AD果蠅攀爬能力得到了增強。研究人員透過光學操縱，有效減輕了果蠅阿爾茲海默症相關症狀，這對進一步在哺乳動物實驗中驗證LOCa對阿爾茲海默症的干預及治療具有重要的指導意義。以上結果均體現了LOCa在生物工程及生物醫學中的潛在應用價值。

圖1. LOCa3的光開關反應及在體應用。（A）設計示意圖，（B）可逆光控鈣訊號，（C）AD-LOCa3果蠅設計示意圖，（D）藍光照射對AD果蠅攀爬能力的影響。

美國德州農工大學博士後何漣與北京師範大學博士生王劉清為該研究的共同第一作者；美國德州農工大學的Zhou Yubin教授、Huang Yun教授，北京師範大學的王友軍教授為共同通訊作者。

Engineering of a bona fide light-operated calcium channel

Lian He, Liuqing Wang, Hongxiang Zeng, Peng Tan, Guolin Ma, Sisi Zheng, Yaxin Li, Lin Sun, Fei Dou, Stefan Siwko, Yun Huang, Youjun Wang & Yubin Zhou

Nat. Commun., 2021, 12, 164, DOI: 10.1038/s41467-020-20425-4

何漣博士簡介

何漣，2018年與美國德州農工大學獲得博士學位，2018年至今在美國德州農工大學健康研究中心Yubin Zhou 教授實驗室從事博士後研究工作。主要研究包括：光控CRAC通路鈣離子釋放及訊號通路調控；運用光遺傳學及化學遺傳學等技術手段對新型小分子抗體（包括nanobody, monodody等）進行改造及進化。在Nature cell biology，Nature Communications，Advanced Science 和elife 等國際頂級期刊上發表研究論文三十餘篇，完成4項發明專利。

研究思路分析

Q：這項研究最初是什麼目的？或者說想法是怎麼產生的？

A：隨著光遺傳學方法和技術的不斷完善和發展，這一技術已經成為神經研究領域不可或缺的研究工具。光敏感離子通道蛋白（Channelrhodopsin-2, ChR2）可以在特定波長的光照刺激下對多種陽離子產生通透性 （如H+, Ca2+, K+等）從而透過改變細胞膜電位達到刺激神經元興奮的目的。但是，在神經細胞中廣泛應用的ChR2缺乏離子選擇性，限制了其在非興奮性細胞和組織中的應用。鈣作為細胞內訊號傳遞的第二信使，參與了很多重要的生理活動。我們是想開發一種光調控鈣特異性啟用的光遺傳學工具，從而可以在時間上和空間上對鈣訊號進行調控達到控制相關鈣訊號通路傳導的目的。這也有助於解析“鈣密碼”，也就是不同鈣訊號在啟用特定生理功能中發揮的作用。

Q：研究過程中遇到哪些挑戰？

A：我們選擇了一個鈣特異性的離子通道CRAC，想透過對其進行光遺傳學的改造實現光調控的目的。但是，CRAC通道是由四次跨膜蛋白ORAI組裝成的六聚體結構。和本身是光敏蛋白的ChR2通道不同，我們需要透過對ORAI引入光敏感蛋白實現ORAI的感光。就現有的技術而言，直接在離子通道上進行改造對於我們具有很大的挑戰性。光敏蛋白的插入位點，接頭序列的長短及型別，是否需要引入ORAI啟用突變，這些都是需要考慮的問題。經過合作團隊長達5年多的不懈努力，我們最終取得了成功。

Q：該研究成果可能有哪些重要的應用？哪些領域的企業或研究機構可能從該成果中獲得幫助?

A：透過本項研究，我們成功開發出一種藍光調控的鈣特異性的離子通道LOCa。有望利用LOCa對鈣訊號的開關提供鈣失調相關疾病的干預及治療，例如：免疫缺陷，阿茲海默症，腫瘤。我們相信本研究也會對CRAC通路參與的免疫調控等基礎研究，藥物研發等起到積極的推動作用。