摘要：TA克隆又叫T—載體克隆,是利用Taq聚合酶的特性將PCR產物高效克隆的方法。該實驗經過7個過程:聚合酶鏈式反應(PCR)、PCR產物的鑑定和純化、重組DNA的構建(連線)、大腸桿菌感受態細胞的製備、轉化和篩選使得大腸桿菌獲得新的遺傳性狀。結果表明:經過PCR和純化反應獲得了一定數量且長度約為400bp的片段,其濃度達到51.5 ng/u L。經過藍白斑篩選獲得了可能具有外源DNA片段插入的白色細菌菌落。

　　關鍵詞：pMD18-T,藍白斑篩選,PCR,電泳,純化

　　1 前言

　　1.1 聚合酶鏈式反應

　　聚合酶鏈式反應(PCR)是利用DNA模板序列的兩端互補的一對寡聚核甘酸引物來擴增一段DNA序列。經過三步反應,即變性,引物退火和聚合的迴圈來相對延伸,經過n次迴圈後目標分子會擴增至2 n。

　　1.2PCR 產物的鑑定和純化

　　擴增後的PCR產物的量和片段長度會直接影響到後續的連線反應,因此需要將擴增後的產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑑定,來測定並分離不同大小的DNA片段並根據顯色的結果判斷產物量的多少。經過PCR成功擴增後,其反應體系中還含有遊離的d NTP,金屬離子和酶。本實驗使用Bio Flux柱離心式PCR產物純化試劑盒,快速、有效地純化PCR反應產物中的DNA片段。

　　1.3 重組 DNA 的構建(連線)

　　TA克隆技術(TA cloning)利用Taq聚合酶具有末端轉移酶(Td T)活性,但卻不具有3'-5' 端外切酶校準活性的特點,可在PCR產物的3' 端加上一個非模板依賴鹼基“A”。p MD18-T是一種高效克隆PCR產物的專用載體,它是由p UC18載體在Xba I和Sal I識別位點間插入一個Eco R V位點,然後用Eco RV進行酶切使質粒線性化,並在它的3' 端新增“T”構建而成。因其3' 端帶有一個突出的“T”尾,能高效地與帶“A”尾的PCR產物連線,極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產物最簡便、快捷的方法。

　　1.4 大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化

　　人們發現用含鈣離子的的溶液處理大腸桿菌細胞會易於吸收外源的DNA,這一過程稱為轉化。被鈣離子預處理過的細胞稱為感受態細胞。

　　1.5 藍白斑篩選

　　轉化細胞培養好後,首先需要一種篩選含有重組質粒的方法。若將轉化的細胞塗布於含氨苄青黴素的平板上,則只有那些含有被轉化的質粒,表達β- 內醯胺酶的細胞才能生存並繁殖。但卻無法確定哪個克隆中含有帶有目的基因的片段的重組質粒。藍白斑篩選可在同一轉化平板上完成篩選。它利用一種藍色化合物的形成為指示劑。當大腸桿菌表達lac阻抑物,則載體上的lac Z基因就由IPTG誘導表達,表面形成的酶就可以利用底物X-gal形成一種藍色化合物。重組質粒的lac Z基因因插入失活而不能形成藍色菌落。白色菌落未表達β- 半乳糖苷酶,因而可能含有插入的目的基因片段,需要進一步的實驗證明。

　　2 正文

　　2.1 實驗材料

　　CRYSTAL IS-RDD3恆溫振盪器、Xiang Yi H-1650臺式高速離心機、UVP凝膠成像系統、Biometra Thermocycler PCR儀、EPS 301電泳儀、Nano Drop 2000超微量分光光度計、Bio Flux柱離心式PCR產物純化試劑盒

　　2.2 方法步驟

　　2.2.1PCR擴增

　　在4個0.2m LEP管中按順序加入以下試劑:36.5 u Ldd H2O、5 u L10×PCR緩衝液、4 u Ld NTP、2 u L3’AOX下游引物、1u L5’AOX上游引物、1 u LDNA模板、0.5 u LTaq酶。上述試劑加好後蓋好蓋子,手彈均勻後,短暫離心後,放入PCP反應儀,設好如下程式即可:95℃5min變性;94℃30s變性;57℃30s退火;72℃30s延伸,迴圈31次後,72℃7min延伸,4℃終止。

　　2.2.2PCR 產物的鑑定

　　(1)膠的製備(1% 瓊脂糖)

　　稱取0.2g瓊脂糖和20m L 1×TAE緩衝液於錐形瓶中,用稱量紙包好瓶口,置於微波爐中加熱至完全融化(重複3次)。將融化好的瓊脂糖冷卻至50-60℃(手能勉強拿住),把梳子預先插入制膠的模具中,緩緩倒入液體,形成一層均勻的膠面,待膠完全凝固後,小心的拔出梳子,並取出膠塊放入電泳槽的緩衝液中。

　　(2)電泳

　　從4個EP管中各取5u L樣品,分別與1u L溴酚藍染料混勻,加入加樣孔中。最後加入加標準DNA marker。接通電源,按照需要調節電壓。電泳結束後將凝膠浸入溴化乙錠(EB)中染色5 min。觀察4管中的PCR反應是否成功。若PCR反應成功,則觀察PCR產物的量以及片段的大小。

　　2.2.3 PCR 產物的純化

　　取1個0.2ml的EP管按1:1的比例加 入如下試 劑: 如180u L PCR產物 + 180u L Binding Buffer

　　將混勻的上述溶液各自轉移至離心柱中,室溫靜置1min後,進行12000r/min離心1 min, 棄去下層廢液;往柱子中加入750ul的wash buffer, 12000 r/min離心1min後 , 棄去廢液;往柱子中加入500ul的wash buffer, 12000 r/min離心1min後 , 棄去廢液;將柱子12000 r/min離心1min後,轉移到1.5m L的EP管中,並加入25u L的Elution Buffer,室溫靜置1min ,最後12000 r/min離心1min ,棄去柱子,儲存離心管中的片段,至此PCR產物純化完成。

　　2.2.4 PCR 產物濃度的測定

　　取1u L的PCR純化產物用Nano Drop 2000超微量分光光度計進行其濃度和OD值的測定。將測好的濃度轉化為相應的複製數公式:Pmol of ds DNA=ug(of ds DNA)*1515/Nbp

　　2.2.5 連線

　　按順序在0.2u L的管中建立如下10u L的連線反應體系:5uL SolutionⅠ、1.6 uL PCR產物、2.4 uL ddH 2O、1 u LPMD18-T載體。因為PCR產物的複製數應是PMD18-T載體複製數的10倍,才能保證連線效率。在瓊脂糖凝膠電泳的結果中,已知PCR產物的大小為400bp,且測得ds DNA濃度51.5 ng/u L帶入公式Pmolof ds DNA=ug(of ds DNA)*1515/Nbp,則得到PCR需加入1.6ul。

　　2.2.6 大腸桿菌感受態細胞的製備

　　將1m L細菌培養物放在的無菌EP管中,冰浴15分鐘後放在4℃的離心機中8000r/min離心1分鐘,倒掉上清,取1m L預冷的氯化鈣製成單細胞懸液(吹吸均勻),放在4℃的離心機中8000r/min離心1分鐘,倒掉上清,再取1m L預冷的氯化鈣製成單細胞懸液(吹吸均勻),冰浴30分鐘後,放在4℃的離心機中8000r/min離心1分鐘,倒掉上清,加入100u L預冷的氯化鈣並吹吸均勻,冰上放置即為感受態細胞。

　　2.2.7 轉化

　　無菌條件下吸取感受態細胞懸液100u L(可將2管混勻)放在1.5m L的無菌EP管中,立即放在冰上。

　　將10u L連線體系中的液體全部吸入上述EP管,並混勻,冰上放置30分鐘。在42℃恆溫水浴鍋中熱擊90~120秒。熱擊後迅速置於冰上3~5分鐘。向管中加入1m L的LB液體培養基,混勻。在37℃搖床上振盪培養1個小時。

　　2.2.8 藍白斑篩選

　　將搖好的菌液進行短暫離心,吸掉上清液750u L,餘下的直接吹吸均勻製成單細胞懸液。全部塗在含IPTG和X-gal以及抗生素的培養基上,37℃倒置培養16~24小時。