隨著生物技術的快速發展，微生物組學在生態環境、農業、醫藥等領域有廣闊的應用前景。在高通量測序技術的推動下，微生物組測序可應用於微生物組分析、病原識別、腫瘤分析、免疫應答分析等領域。

2020年12月26日，“微生物組測序與分析專家共識”在《生物工程學報》釋出。共識由國科學院院士、中國疾控中心主任、中國生物工程學會理事長高福，以及中國科學院微生物研究所研究員、中國生物工程學會微生物組學與技術專業委員會主任朱寶利，計算生物學與生物資訊學專業委員會副主任陳禹保等共同牽頭，邀請了來自 20 多個單位的專家和 30 多位來自企業的工作人員，共同制定完成。中國科學院微生物研究所朱寶利教授為通訊作者。

圖片來自《專家共識》，侵刪

《專家共識》主要針對基於高通量和單分子基因測序平臺，對人類、動植物或環境樣本中的微生物基因進行測序以及資料的生物資訊學分析。共識重點圍繞微生物組測序與分析技術，包括微生物組學相關的樣本採集、儲存和測序技術、資料分析和生物資訊學分析技術的應用，標準品的設計和使用規範等，涉及微生物組研究的各個環節。

《專家共識》對微生物組測序的全流程提出了具體的規範要求，並形成詳細的操作標準流程和質檢標準，為將來的行業共識和國家標準打下基礎，以期指導中國的微生物組科研和臨床研究和應用，為國家相關職能部門以及中國的微生物組計劃提供可供參考的技術依據，為形成中國自己的微生物組相關的標準體系奠定基礎。

《專家共識》細則主要內容如下：

樣品採集：

共識統一了樣品命名格式，提出樣品採集應制定標準化的工作流程。

樣品儲存：

共識提出樣品在轉運過程應保持低溫條件，並最好以DNA 或 cDNA 狀態進行轉運。建議在微生物核酸提取前移除保護劑，並對樣本中殘留儲存劑進行清洗置換。

核酸提取：

核酸提取過程是微生物組研究的最關鍵步驟之一，需注意以下事項：

（1）微生物樣本提取需要考慮不同種類微生物裂解的等效性，即提高難裂解微生物的裂解效率，確保裂解後獲得的核酸資訊最大程度反映樣本真實的微生物多樣性；

（2）確保同一專案使用相同的核酸提取試劑盒；

（3）核酸純化過程中儘可能去除抑制劑，從而減少 PCR 擴增產生的偏差、假陰性，以及核酸定量不準確的問題；

（4）對於 RNA 提取，避免外源 RNase 汙染造成的 RNA 質量不佳；

（5）為了最大程度減少微生物樣本中不同種類微生物裂解不均一的問題，特別是對於含難破壁的微生物樣本，推薦使用研磨珠進行研磨，如氧化鋯、玻璃研磨珠等，提高對不同微生物的細胞壁裂解效率；

（6）使用研磨珠進行物理裂解，可配合使用機械裂解儀或渦旋振盪儀。

核酸提取後，需對核酸質量進行以下三個方面的質控：濃度質控、純度質控、片段完整性質控。

文庫構建：

微生物文庫構建方法有以下幾種：

（1） 擴增子測序：細菌及古菌擴增子測序時，需要對 16S rRNA V1-V9 區段進行擴增。目前，通常使用 V3-V4 區段擴增，該區域基因序列的多樣性對細菌種屬資訊覆蓋度最高。

（2） 元基因組和全基因組建庫：建庫流程有三個步驟：核酸打斷、接頭連線及 PCR 擴增。為避免 PCR 酶在擴增時產生偏好性，在能獲得足夠多 DNA 的條件下，儘量採用 PCR-Free 的實驗方法。

另外還可進行單分子測序的文庫構建。

文庫構建後需進行文庫質控。文庫質控包括對文庫轉化率及文庫濃度和文庫片段分佈分析。文庫質控主要方法有Qubit 檢測、毛細管電泳、qPCR 和超微量核酸檢測儀等。共識對

高通量測序和單分子測序的基因組文庫、轉錄組文庫、擴增子文庫構建分別提出了詳細的質控標準。

測序資料的質控、管理：

資料產出後，NGS 原始資料的質量控制要求包括：

（1） 資料數量 (bp 數和讀段數)，包括原始資料量 (下機資料量)、乾淨資料量 (去除低質、引物和接頭序列) 和有效資料量 (比對上參考基因組序列)；

（2） 質控流程包括：接頭序列、引物序列、低質量序列和冗餘序列評估和去除，參考基因組或目標區域序列比對等步驟。

資料儲存應採用通用的FASTQ、BAM、BCL 等格式。

微生物組資料分析流程：

共識對擴增子測序、元基因組測序、單菌基因組測序的下機資料的分析流程也進行了規範。

報告內容:

資料資訊應包括：1) 基本的測序資訊：如樣本質量、測序平臺，序列質量、測序深度等；2) 樣本資訊：如樣本型別，分組資訊等。分析方法包括：原始序列過濾策略、主要分析步驟、軟體及參考資料庫和質控引數等，並註明採用檢測方法的侷限性、檢測靈敏度和準確度等。

其他:

共識對參考品與質控品、質量控制、資料儲存、隱私保護、知情同意與倫理等方面也提出了具體的標準化流程要求。

Vazyme擁有從核酸提取到高通量測序文庫構建的完整解決方案。該系列產品包括適用於illumina、ion torrent、MGI測序平臺以及三代pacbio平臺的文庫構建的全套產品，如完整的建庫試劑盒、模組以及原材料等，不僅可以向高通量測序使用者提供優質的建庫產品和完整的樣本建庫方案，同時還可以根據使用者需求定製化開發測序相關產品，讓不同需求的客戶擁有更多選擇。

核酸提取及文庫製備

相關產品選擇指南

方案一：PCR擴增文庫製備

針對PCR擴增文庫，可選擇的建庫策略有轉座酶法、片段化酶法、機械打斷法，以及基於AmpSeq超多重靶向擴增的方法，特異性的富集所需檢測內容。

方案二：PCR-free文庫製備

針對PCR-free文庫，可選擇的建庫策略有片段化酶法和機械打斷法，並且對微量的DNA樣本低至1ng亦能高效建庫。

方案一：快速RNA建庫試劑

該試劑盒將二鏈合成、末端修復和dA-Tailing合併為一步，中間不需要純化步驟，極大的簡化了操作流程，將建庫時間縮短至4h。

方案二：轉座酶法RNA建庫試劑

該試劑盒採用新型的轉座酶進行文庫構建，將繁瑣的建庫過程變為一步簡單的酶促反應，適用於低至1ng起始的RNA，並可將文庫構建時間縮短至3h。

方案一：轉座酶法DNA/RNA共建庫

該方案中的轉座酶可同時切割DNA/RNA雜合鏈以及雙鏈DNA。流程是先獲得DNA/RNA共提物後，將嚴格不能核酸中的RNA逆轉錄成cDNA，在對體系中的全部核酸進行切割，能夠真正做到一份樣本、一個流程、一管反應、一天完成。

方案二：快速DNA/RNA共建庫

該方案中先將樣本中的RNA逆轉錄、二鏈合成為雙鏈cDNA。再與體系中的DNA混合後，使用轉座酶法或者片段化酶法構建測序文庫。將繁瑣的DNA和RNA建庫過程簡化為一部共建庫流程，縮短建庫時間。

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共識連結：

http://journals.im.ac.cn/cjbcn/article/abstract/gc20122516