點評 | 項煜晨、彭廣敦（中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院）
撰文 | 十一月
責編 | 酶美
組織是由多種不同類別、不同狀態的細胞組成，同時又受到細胞所在空間位置和組織結構的調節。對於細胞中RNA分子的定位以及身份的多通道測序對於研究基因表達、空間組織結構等關係大有裨益【1-5】。另外，繪製RNAs的亞細胞位置對於理解不同的生物學過程很重要。在細胞中對RNAs的成像以及更細節的細胞形態的分析依賴於奈米級別的精解析度。但是現階段，想要達到如此的解析度並非易事。即使是能夠進行高解析度RNA分子成像的seqFISH+（Sequential fluorescence in situ hybridization）技術也不能解決達到細胞和組織學的奈米級精度這一難題【6】。
為此，美國MIT Edward S. Boyden研究組、Adam H. Marblestone研究組以及哈佛醫學院George M. Church研究組合作在Science上發表新型測序工具，文章題為Expansion sequencing: Spatially precise in situ transcriptomics in intact biological systems，建立了可以用於非靶向（不限定目標基因序列）以及靶向的奈米級別解析度的完整組織中RNA原位測序技術Expansion sequencing。
為了將RNA測序與成像技術解析度進行雙重提升，作者們希望將擴充套件顯微鏡技術（Expansion microscopy）相容到測序技術之中以提高原位測序技術的精度。
首先，作者們希望建立無靶向的擴充套件測序技術，無靶向的技術具有發現空間定位的不同序列變體比如RNA可變剪接的變體以及保留的內含子等的巨大潛能。熒光原位測序技術（Fluorescent in situ sequencing，FISSEQ）可以達到對RNA相應精度的測序，但該技術只在培養的細胞中使用過，其可行性在組織層面上還未被完全證明【7】。因此，作者們將ExM（Expansion microscopy）化學技術【8】與FISSEQ技術相組合，ExM技術可以將臨近的RNA分子區分開，由此得到了Expansion Sequencing技術。具體來說，Expansion Sequencing技術的步驟主要包括（I）樣本固定，將RNA方法分子與Anchor結合；（II）將樣品嵌入可膨脹的凝膠材料中;（III）將RNA分子錨定在凝膠材料之中；（IV）使用RISSEQ技術對RNA分子進行逆轉錄和擴增；（V）原位測序（圖1）。原位測序包括多輪新增熒光寡核苷酸的步驟。另外，為了對得到的3D成像的結果以及持續的鹼基測序進行分析，作者們建立了一個軟體程式碼，可以用對多輪成像進行排列匹配同時對一個斑點畫素中表達的基因進行分離。最後，作者們對這些斑點進行分段並對測序結果進行分析和調取。
圖1 Expansion Sequencing測序步驟全解
為了對ExSeq技術的有效性進行驗證，作者們分別建立了非靶向和靶向的兩種版本。透過使用非靶向ExSeq技術，作者們對小鼠海馬區神經元樹突中存在的轉錄本進行了揭示，其中包括滯留的內含子、轉錄因子以及長非編碼RNAs。透過靶向ExSeq技術，作者們對小鼠視覺皮層中層與層之間特異性的細胞型別進行觀察並對海馬椎體神經元奈米級別間隔中的RNA進行分析。與相鄰的樹突相比，棘突中的mRNA分佈是不同的。另外，作者們還發現不同型別海馬區神經元中RNA樹突狀結構之間分佈具有相似的模式。最後，作者們對人類轉移性乳腺癌活檢樣品進行ExSeq技術分析，繪製了不同型別細胞表達不同基因的圖譜，該圖譜可以作為識別不同型別細胞以及不同細胞之間的距離的重要參照。
總的來說，ExSeq可以在完整的細胞和組織中實現從奈米尺度到系統尺度的RNA多通道分析。透過對小鼠腦部海馬區神經元的額分析，揭示了RNA的定位原則對於不同的細胞型別的適用程度。人類癌症的背景下，作者們對不同細胞型別的基因表達差異進行了分析，並建立了對不同細胞型別與其他細胞型別距離函式，為癌症中細胞相互作用的研究提供重要工具，同時也為未來的治療方法提供可能的見解。
專家點評項煜晨、彭廣敦（中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院/生物島實驗室細胞譜系研究中心）
隨著單細胞RNA測序技術的日漸普及，我們對組織內細胞的身份資訊和狀態的認知有了很大提升，甚至成功繪製了小鼠和人類部分組織或發育時期的細胞圖譜。然而，以空間資訊丟失為代價的單細胞測序技術對我們精準解析細胞在組織內部的功能資訊造成了很大障礙，尤其是當空間位置資訊對細胞命運、功能存在決定性或不可忽視的影響時（如胚胎髮育，類器官，腦組織以及腫瘤組織內部），空間轉錄組技術應運而生。
原Broad institute core member faculty，人類細胞圖譜計劃的發起者之一Aviv Regev曾經有過一個形象的比喻：如果說Bulk-RNA-seq是水果奶昔，scRNA-seq是水果拼盤，那空間轉錄組就是水果餡餅。隨著近年來人們對轉錄組在空間上分佈的認識和興趣逐漸加深，空間轉錄組技術無論在技術開發，還是大規模的應用和商業化都得到了蓬勃發展。今年Nature Methods更是將Spatially resolved Transcriptomics評為Methods of the year，可以說有望與單細胞測序媲美並引領下一代技術革新的年代或已開啟。
不同於探針庫雜交，2003年來自哈佛大學的George Church 團隊開發了第一代原位測序（in situ sequencing）技術，FISSEQ；並在2014年發表了第二代FISSEQ。FISSEQ利用random hexamer作為引物結合到基因的轉錄本上，在完成交聯、成環、rolling cycle amplification之後，利用雙鹼基測序技術SOLiD實現原位測序。FISSEQ的原理也一直被後續的原位測序技術所借鑑。
與此同時，來自MIT的Edward Boyden和陳飛師徒於2015年開發了Expansion Microscopy。這一技術透過將生物大分子、小分子、或者其替代的標記物交聯到可吸水放大的acrylamide膠上，再將組織吸水放大（放大比例約為4倍，並可以迭代使用增加放大倍數）。這種技術可以減少成像訊號的堆積干擾，已經先後應用在蛋白、RNA、代謝物等各種組織細胞內的生物分子中。常規的Expansion Microscopy可以在常規的microscopy的基礎實現奈米級的空間精度，如果與更高成像檢測能力的Confocal，STORM等結合，甚至可以進一步提升放大倍數。
首先將in situ sequencing和Expansion Microscopy結合的是來自斯坦福大學的Garry Nolan和Broad institute的王瀟團隊（詳見：乾貨解讀 | 解析完整腦組織中的三維原位轉錄圖譜）。他們開發的STARmap也利用了acrylamide gel來實現組織立體固定，結合組織透明化透過已知基因的primer來釣取轉錄本，在經歷反轉、成環、rolling cycle amplification之後，用另一種更為精確的雙鹼基測序技術SEDAL完成原位測序。組織透明化也使得STARmap成為首個直接在三維組織上做空間轉錄組的技術。然而，STARmap並沒有充分利用這兩種技術的優勢。首先，其仍然利用已知基因的primer去做反轉，這樣得到的是需要先驗知識的基因組合（可基於單細胞轉錄組測序的預篩選後進行）；其次，雖然STARmap使用了acrylamide gel，但並沒有吸水放大，所以空間精度也並沒有大範圍提升。
兩年之後（文章曾2020年首發於BioRxiv），George Church和Edward Boyden團隊強強聯合，成功開發了Expansion sequencing（ExSeq）這一技術。ExSeq首先用untargeted random primer去釣取轉錄本，在完成Rolling cycle amplification後，將形成的nanoball cDNA交聯在acrylamide膠上，吸水放大，用unchanged gel做一遍re-embedding之後再用SOLiD 做原位測序。同時，在原位測序結束後，這些nanoball cDNA被回收送去二代測序，測序結果會與原位測序的結果mapping起來。相比於FISSEQ，Exseq將組織放大後進行原位測序，避免了nanoball cDNA的molecular crowding。此外，ExSeq將in situ sequencing的結果和ex situ sequencing的結果做remapping，使得全長的轉錄組資訊及其空間位置得到解讀。相比於seqFISH+和MERFISH，ExSeq基於untargeted random primer去做in situ hybridization，避免的biased probe selection，也在一定程度上降低了成本。ExSeq的隨機引物反轉，具有較長的測序讀長，因此還有一個好處，可以實現剪下體的檢測。但非靶向測序含有大量的核糖體基因，對非核糖體基因檢測的靈敏度還很低。
相比於其他門類的空間轉錄組技術（Array-based、LCM-based、Photon-based、microfluidic-based、informatic-based），基於原位雜交的技術空間精度最高。但產出效率、訊號強度，以及在3D完整組織中的還原等方面往往無法做到平衡，整體價格較昂貴也使得其難以在更多實驗室普遍的推廣。
與單細胞技術發展歷程相似，隨著空間轉錄組技術的成熟，更多的研究者也將目光放在了空間多組學技術的開發，尤其是蛋白組（如Garry Nolan團隊的CODEX，樊榮團隊的DBiT-seq）和表觀組（莊小威團隊DNA-MERFISH、蔡龍團隊DNA-seqFISH、陳飛-Edward Boyden-Jason Buenrostro團隊的in situ genome sequencing，C. ting Wu的 oligoFISSEQ）。相信在未來10年內，空間組學將繼續迎來井噴式的發展和應用，有望擴充套件到單細胞測序遍及的所有領域。
原文連結：
https://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.aax2656
製版人：十一
參考文獻
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