撰文 | 凌峰

責編 | 奕梵

瞭解與研究蛋白質間的相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI），是理解細胞內發生若干生物化學活動的第一步。在眾多的PPI研究方法中，通常將蛋白質分為誘餌蛋白與獵物蛋白，利用酵母的生長（Y2H），觀察活體細胞中的熒光（熒光能量轉移，Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET或雙分子熒光互補，Bimolecular Fluorescent Complementation，BiFC）以及採用各類體內與體外的沉澱法（免疫沉澱或親和純化等）等方法，檢測誘餌蛋白與獵物蛋白之間的相互作用【1】。難以避免的是，每種方法都具有侷限性，必須基於一種以上的PPI方法，才可以得出可信的結果【1】。雖然，這些方法都在植物PPI的研究中較為廣泛的應用，但是，我們仍需要發展新的PPI方法，尤其能夠解決現有方法的侷限性。雷帕黴素（Rapamycin）作為一種化學分子，能夠介導分別含有FKBP（FK506-Binding Protein）結構域與FRB（FKBP-Rapamycin-Binding）結構域的蛋白形成異二聚體。雷帕黴素與FKBP結構域結合形成複合體，並進一步與FRB結構域結合。利用這一特性，前人在人類細胞中建立了用於研究蛋白功能的Knocksideways系統【2】。將線粒體定位訊號、熒光蛋白與FRB結合為線粒體錨定蛋白（圖1，綠色蛋白），同時，將待檢測蛋白與FKBP結構域相連（圖1，紅色蛋白），在施加雷帕黴素後，待檢測蛋白會重定位於線粒體中。由於待檢測蛋白的非正常定位，無法發揮其功能，配合其他檢測方法可以研究其功能【2】，可用於研究物件突變體致死的環境下。雷帕黴素能夠形成二聚體的作用已經在不同型別的生物體中得以應用【3-5】，但少見於植物細胞中【1】。

圖1 Knocksideways系統【2】

2021年1月25日，來自比利時根特大學Daniël Van Damme團隊在 The Plant Cell發表了題為Visualizing protein-protein interactions in plants by rapamycin-dependent delocalization的研究論文。該研究利用雷帕黴素能夠調控異二聚體在細胞內的形成這一過程，建立若干不同細胞結構定位訊號的FRB融合蛋白，利用熒光共聚焦顯微鏡，選取已知互作蛋白，驗證並建立，可應用於植物細胞中的KSP（Knocksideways in plants）蛋白互作檢測系統，並且探討了其適用性與侷限性，提出了進一步改進的方法。

在該研究中，作者基於Knocksideways系統【2】，結合已知的研究結果，利用MultiSite Gateway技術，建立了融合不同細胞結構定位訊號的FRB蛋白（定位訊號-熒光分子-FRB），包括微管、細胞核、線粒體以及細胞膜。在熒光共聚焦顯微鏡的觀察下，菸草表皮細胞中，連線不同訊號分子的FRB融合蛋白都能夠定位於相應的細胞結構上。作者進一步，將細胞結構定位與FRB融合蛋白不同的誘餌蛋白，連線 FKBP蛋白（誘餌蛋白-mCherry-FKBP或FKBP-mCherry-誘餌蛋白），共同在菸草中表達兩個融合蛋白。施用雷帕黴素後，融合FKBP的誘餌蛋白在雷帕黴素的作用下，重新定位於含有FRB融合蛋白的細胞結構上。至此，驗證了雷帕黴素在植物細胞中，能夠介導異二聚體形成。在此基礎上，作者利用已知的蛋白相互作用，將獵物蛋白與GFP蛋白相連，在施加雷帕黴素後，獵物蛋白與誘餌蛋白能夠共定位在特定細胞結構上。比如，利用KSP系統，重現了SACL蛋白與LHW蛋白的互作【6】。在雷帕黴素處理後，熒光訊號位於細胞核中的SACL-GFP與LHW-mCherry-FKBP，轉移到了線粒體上，與線粒體定位的MITO-TagBFP2-FRB訊號重疊。基於以上結果，表明KSP系統具有可誘導性。此外，為了探討KSP的可逆性與穩定性，作者引入了雷帕黴素的拮抗物子囊黴素（Ascomycin），其能夠競爭性結合FKBP結構域【7】。實驗結果表明，在雷帕黴素處理後，5分鐘內就可以觀察到熒光訊號的重定位現象。在此基礎上，再經歷子囊黴素處理，熒光訊號重定位現象仍然能在24小時後觀察到。為了對蛋白質重定位進行定量分析，作者也提供了基於ImageJ/Fiji軟體的指令碼與操作手冊，在圖片標準化處理後，配合指令碼實現了圖片批次處理，可以對施加雷帕黴素前後，熒光訊號位置變化進行相對定量。隨後，作者也探討了KSP的侷限性。在該系統中，定位於細胞核中的KRP2蛋白，在雷帕黴素處理後，無法觀察到較為明顯的重定位現象。最後，作者探討了KSP系統的前景與改進方向。比如兩個以上蛋白間的相互作用，特定細胞區域中酶促反應研究與條件性“敲除”基因等。在改進方向上，提出透過引入組織特異性啟動子，或將多個表達框整合到同一載體上等方法，有望拓展KSP系統的適用性。

總而言之，基於文章中實驗結果，KSP系統是一個在植物細胞中研究蛋白質相互作用的有力工具。作者透過改進Knocksideways系統【2】，使之較為系統性地應用於植物細胞中PPI研究，相比較於其他適用於植物細胞中的系統具有特定優勢。1. 雷帕黴素施用與否，本身可以作為實驗對照。在施用後，極短時間內就能觀測到結果，且可持續至24小時。2. KSP相較於BiFC與FRET，其相互作用結果讀取，並不依賴熒光基團的互補或基團之間的空間距離。但是，KSP系統在檢測蛋白互作中具有一定的侷限性。相對於可移動性較高的蛋白（如定位於微管與細胞質），或具有多種亞細胞定位的蛋白，有特定且穩定分佈的蛋白(比如位於細胞核的KRP2)， KSP的作用不明顯。再者，KSP表現出可以檢測兩個以上蛋白的相互作用，但無法瞭解第三個蛋白是促進或競爭結合。有需要的讀者，可以參考近期發表在Plant Physiology上利用酵母，檢測第三個蛋白如何調控蛋白互作的Tri-SUS系統【8】。

參考文獻

1. Struk, S., Jacobs, A., Sánchez Martín-Fontecha, E., Gevaert, K., Cubas, P., & Goormachtig, S. (2019). Exploring the protein-protein interaction landscape in plants. Plant, cell & environment, 42(2), 387–409. https://doi.org/10.1111/pce.13433

2. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., & Foster, S. D. (2010). Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental cell, 18(2), 324–331. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2009.12.015

3. Putyrski, M., & Schultz, C. (2012). Protein translocation as a tool: The current rapamycin story. FEBS letters, 586(15), 2097–2105. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2012.04.061

4. Hughes, K. R., & Waters, A. P. (2017). Rapid inducible protein displacement in Plasmodiumin vivo and in vitro using knocksideways technology. Wellcome open research, 2, 18. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.11005.1

5. Wood, L. A., Larocque, G., Clarke, N. I., Sarkar, S., & Royle, S. J. (2017). New tools for "hot-wiring" clathrin-mediated endocytosis with temporal and spatial precision. The Journal of cell biology, 216(12), 4351–4365. https://doi.org/10.1083/jcb.201702188

6. Vera-Sirera, F., De Rybel, B., Úrbez, C., Kouklas, E., Pesquera, M., Álvarez-Mahecha, J. C., Minguet, E. G., Tuominen, H., Carbonell, J., Borst, J. W., Weijers, D., & Blázquez, M. A. (2015). A bHLH-Based Feedback Loop Restricts Vascular Cell Proliferation in Plants. Developmental cell, 35(4), 432–443. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2015.10.022

7. Li, J. F., Bush, J., Xiong, Y., Li, L., & McCormack, M. (2011). Large-scale protein-protein interaction analysis in Arabidopsis mesophyll protoplasts by split firefly luciferase complementation. PloS one, 6(11), e27364. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0027364

8. Zhang, B., Xia, L., Zhang, Y., Wang, H., & Karnik, R. (2020). Tri-SUS: A Yeast Split-Ubiquitin assay to examine protein interactions governed by a third binding partner. Plant Physiology. kiaa039, https://doi.org/10.1093/plphys/kiaa039

原文連結：

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koab004/6119326