CRISPR是一種革命性的基因組編輯技術，是一項有可能會改變世界的技術。雖然這還是一個相對較新的發現，但很快，CRISPR將成為用於生物學研究標準的實驗工具。CRISPR最廣泛應用之一是敲除特定基因以瞭解該基因的功能。實驗通常需要同時轉染大量細胞，形成具有不同Indel的基因編輯細胞混合克隆，也被稱為KO（敲除）pool。CRISPR介導產生的KO pool取代了較傳統的基於RNAi的方法，正逐漸成為許多研究細胞系基因功能的研究人員的首選方法。KO pool混合了野生型和編輯過的細胞，敲除效率可能會隨時間而變化。但是，對於短期測定來說，KO pool是非常有用的。
應用：具有高敲除效率的KO pool適合直接用於許多型別的測定，而不需要額外挑取單克隆細胞來進行測定，因為基因型畸變可以直接影響到表型狀態。因此，KO pool在以下研究領域具有廣泛的應用：
1. 增殖測定
2. 基因發現：識別新的癌症驅動基因並發現癌症特異性脆弱性。
3. 藥物反應/藥物靶標識別
4. 疾病模型發展
5. 抗體驗證（免疫印跡/免疫熒光）
CRISPR-U™ 基因編輯KO poolCRISPR/Cas9系統是一種有效的基因組編輯系統，透過用gRNA和所需的donor序列打靶和取代靶基因序列，進行基因敲除或敲入的基因組編輯操作。透過CRISPR技術製作KO pool，可節省單克隆化而花費的時間和成本。如今，科學家開始從RNAi轉移到使用KO pool進行基因的早期探索性研究，因為KO pool降低了進入的成本，並且與RNAi非常相似。此外，CRISPR技術可以產生穩定的蛋白質功能敲除，可以提供比RNAi更徹底的結果。具有更高效率的KO pool對於藥物靶標，藥物反應，抗體驗證，疾病模型開發以及各種功能測定的研究來說非常有用。為了加快生物醫學研究的發展，源井生物開發了CRISPR-U™系統，應用於快速而精確的細胞基因編輯。此外，CRISPR產生的KO pool可以與功能喪失測定，高通量篩選，抗體驗證和安全藥理學研究相結合。源井生物可以定製基因編輯敲除細胞系和KO pool。
圖: 定製CRISPR-U™ KO pool的工作流程
源井生物開發的CRISPR-U™最佳化細胞的基因編輯。其效率和準確性高於傳統方法。請立即聯絡我們瞭解與您的研究相關的服務吧！
運用：KO pool可用於研究表達量過低或不可檢測的靶蛋白基因
基於CRISPR/Cas9的基因敲除（KO）能夠精確擾亂靶基因的功能，並且在理想情況下，透過人類細胞中的分子組學讀數將以無偏差的方式分析這些現象。一般來說，這需要一個分離KO單克隆的漫長過程。在這項研究中，研究人員使用了一種策略，避免了進行單克隆分選，並透過使用在基因組上打靶接近序列（40-300 bp）的兩個gRNAs的協同組合，在KO pool上實現了快速而有效的基因沉默。研究人員在HepG2細胞中敲除吡哆醛激酶（PDXK）並生成PDXK-KO pool。同時，研究人員還製備PDXK-KO單克隆來進行比較。他們比較了KO單克隆和KO pool中產生的表型蛋白質組學資料。
圖1: PDXK-KO細胞的蛋白質組學表型
重複實驗之間的標準差顯示了KO pool的資料集比三個PDXK-KO單克隆資料集顯示出更小的變化（見圖1A）。無偏差全蛋白質組分析在HepG2 KO pool中鑑定出了6種顯著下調的蛋白質，而在KO克隆中，只鑑定出4種顯著下調的蛋白質。我們需要用MS定量對同源蛋白的殘留水平進行檢測，以排除該截短蛋白在早期終止密碼子或外顯子跳躍後仍表達，而這可能會擾亂KO表型的分析和解釋。
因此，基因敲除（KO）pool同樣能夠精確地干擾靶基因功能，可透過分子組學讀數評估基因敲降以及分析KO表型。使用KO pool，可能是比RNAi更好的研究基因功能的方法。
源井生物開發的CRISPR-U™優化了真核細胞和動物基因編輯載體和過程。效率和準確度比傳統方法高10倍。立即聯絡我們瞭解與您研究相關的基因編輯服務！
Reference::
A Tandem Guide RNA-Based Strategy for Efficient CRISPR Gene Editing of Cell Populations with Low Heterogeneity of Edited Alleles. CRISPR J.2020;3(2):123-134.