責編 | 酶美

活細胞單分子追蹤技術（Single Molecule Tracking，SMT）是利用高分辨熒光顯微鏡對細胞內單個特定分子進行定位和追蹤。由於SMT技術能夠實時監控某種分子（如蛋白，核酸）在活細胞內的動態，這項技術為研究分子功能，結構，以及分子間的相互作用提供了重要的動力學依據。儘管SMT技術發展迅速，目前的研究通常只能追蹤某一種分子的運動軌跡。在活細胞內對多種單分子進行實時追蹤還存在著樣品標記、光學設計和資料分析上的諸多難點。眾所周知，蛋白相互作用是細胞訊號傳導的分子基礎，這一缺陷阻礙了利用SMT技術在活細胞內研究分子訊號通路的更廣泛應用。

近日，陳忠文（前Jay Groves組博後，現任復旦大學研究員）與曹宇虹（前楊培東組博後，現任國家奈米中心研究員）合作在 PNAS 上發表題為 Nanopore Mediated Protein Delivery Enabling 3-color Single Molecule Tracking in Living Cells 的研究論文。這篇論文主要描述了利用一種新型奈米電穿孔技術（NanoEP，楊培東組在2018年中發表於PNAS：Nontoxic Nanopore Electroporation for Effective Intracellular Delivery of Biological Macromolecules），將體外提純並標記熒光的少量蛋白分子遞送輸回細胞內，從而實現在細胞內同時追蹤2到3種不同蛋白單分子（圖1）。這項新方法為觀測細胞內蛋白在訊號傳導中的相互作用提供了更高的時空解析度。

圖1

為驗證該方法的可行性，作者追蹤了細胞膜EGFR訊號通路中的關鍵蛋白分子Grb2，SOS，和 Ras。課題組首先驗證了透過奈米孔遞送的在體外提純並被熒游標記的Grb2蛋白具有與細胞內天然表達的Grb2相似的蛋白活性。在EGFR啟用以後，細胞質中的Grb2結合到EGFR上並形成半徑為160nm的團簇。多通道單分子追蹤發現，SOS會晚於Grb2結合到EGFR上，揭示了EGFR:Grb2:SOS複合體形成的動態過程（圖2）。而Ras並不會聚集於EGFR周圍，提示被SOS啟用的Ras會迅速在細胞膜擴散，因而作者提出EGFR受體啟用後形成的團簇與Ras引起的下游MAPK訊號傳導在空間上是分隔開來的。

圖2

最後，作者將該技術擴充套件到了小鼠原代T細胞。原代細胞往往難以轉染，實現單分子成像的挑戰更大。透過奈米電穿孔，作者成功實現了原代T細胞的蛋白遞送與熒光成像，且細胞保持很好的活性（圖3），極大拓展了該技術的應用範圍。

圖3

據悉，該研究系陳忠文博士和曹宇虹博士在美國加州大學伯克利分校進行博士後期間合作共同完成，加州大學伯克利分校的楊培東教授和Jay T. Groves教授為本文共同通訊作者。陳忠文（復旦大學）和曹宇虹（國家奈米科學中心）均已全職回國建立實驗室。

原文連結：

https://www.pnas.org/content/118/5/e2012229118

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