撰文 | 餘梁

審稿 | 陳梓豪

指導 | 閔小平（廈門大學）

今天給大家介紹的是由哈佛大學Stuart L. Schreiber教授在 Cell 上發表的文章”The Rise of Molecular Glues”。

2021年是發現環孢菌素A（cyclosporin A）和FK506以一種從未見過的方式發揮作用的30週年，即介導蛋白質-蛋白質結合的“分子膠水”。隨著新型分子膠水探針和藥物的大量湧現，人們對“分子膠水”這一領域的興趣越來越濃厚。本文以奠基者的視角回顧了這個領域的發展軌跡。

01 背 景

早在人們知道環孢素A（cyclosporin A，CsA；sandimmune）是一種分子膠水之前，1971年瑞士製藥公司Sandoz的一名生物學家和妻子在挪威度假時，發現了一份土壤樣本。作為一項旨在發現含有抗真菌抗生素的微生物的篩選計劃的一部分，員工通常會收集這些樣本，但土壤含有的CsA的免疫抑制活性引起了Sandoz的注意。1979年，CsA被用於防止器官移植排斥反應，並於1983年被FDA批准。

與此同時在1983年，日本製藥公司Fujisawa正開發一個專案，專案透過篩選新的生物活性微生物產品來尋找免疫抑制劑。在1987年，他們發現FK506（tacrolimus），這是一種新的由23個部分組成的大環內酯，它具有與CsA相似的活性，但更有效並且似乎在器官移植患者中得到更好的結果。

02 分子膠水的發現

80年代中期，作者在耶魯遇到了Bob Handschumacher，他給作者介紹了CsA靶向親環素免疫抑制（CsA targeting cyclophilin for immunosuppression）。親環素（cyclophilin）是一種小的（18kD）並具有一種奇特酶活性的蛋白質，它可以催化蛋白質中脯氨酸（prolyl）的順式和反式旋轉異構體的相互轉化。事實證明，CsA抑制了這種“肽基-脯氨酸異構酶”的活性。但親環素與免疫抑制之間沒有顯著聯絡。因為脯氨酸異構化非常容易發生，而且發生在毫秒到秒的時間範圍內，所以從化學家的角度看，很難想象催化或抑制這一過程對細胞有什麼意義。

那麼，如何將這個看似無關緊要的功能與CsA對T細胞受體（T cell receptor，TCR）介導訊號通路的抑制聯絡起來呢？

作者想知道是否還存在類似性質的化合物。Fujisawa製藥公司（現稱Astellas）透過尋找可以干擾TCR訊號的天然產物發現了FK506。FK506不同尋常的結構——大環聚酮引起了作者的注意，他開始尋找相似結構的化合物。1980年Ayerst科學家在“Canadian Journal of Chemistry”上報道了一種不同但結構也是大環聚酮的雷帕黴素（rapamycin），它是一種抗真菌劑。作者猜測它和FK506同樣具有CsA活性。

與Handschumacher的討論讓作者更加重視FK506和雷帕黴素靶點作用機制的發現。在1988年從耶路搬到哈佛後，作者利用親和層析法（affinity chromatography）快速找到了FK506和雷帕黴素的靶點。雖然第一個靶標FKBP12與這兩種化合物均有亞奈米摩爾相互作用（subnanomolar interactions），但其它靶標表現出差異結合（differential binding），而FKBP12與雷帕黴素表現出選擇結合（selective binding）。值得注意的是，每一個FKBPs如同之前的親環素一樣，顯示出對藥物敏感的肽基-脯氨醯異構酶活性。親環素和FKBPs被命名為免疫因子（immunophilins）。

FKBPs釋放了一系列確定的活動，以利用化合物作為它們所調節的生物探針。免疫學的研究者們將細胞內訊號傳導描述為一個“黑匣子”，並注意到最強大的探針——細胞表面受體的抗體無法穿透細胞膜，而小分子卻可以。作者與其他研究者在1990年有了一個驚奇的發現：結構相關的FK506和雷帕黴素破壞兩個截然不同的通路。FK506干擾TCR訊號，而雷帕黴素干擾IL2受體訊號。更令人費解的是，親環素-CsA複合物的行為類似於FK506複合物，儘管它沒有與FKBP12結合。這一奇怪的結果提出了一個新的可能，那就是FKBP12-FK506和FKBP12-雷帕黴素複合物具有不同的特性，並且針對不同的通路。如果這是真的，那麼簡單地結合FKBP12將不足以實現這些變數應答，但競爭性結合可以阻止這些化合物作用。為了驗證這一假設，作者設計了非天然大環506BD（FK506和雷帕黴素的FKBP12結合域），並實現了其多步合成。506BD能明顯消除FK506和雷帕黴素的細胞活性（但不能消除不與FKBP12的CsA）。

作者將分子膠水的作用過程類比登月活動，認為KFBP12可能起到類似指令艙的作用，免疫抑制劑充當對接元件，但還沒有找到登月艙。為了找到它，博士後Liu擴充套件了作者的親和層析法研究，這次使用了親環素-CsA、FKBP12-FK506和FKBP12-雷帕黴素作為誘餌。

Liu發現親環素-CsA和FKBP12-FK506結合蛋白磷酸酶（protein phosphatase calcineurin），如圖1所示。CsA和FK506被命名為分子膠水！這個術語在第二年被髮表，啟發了Schreiber等人對抗肽選擇性粘合特定MHC和TCR蛋白作為免疫應答手段的類似工作。FKBP12-雷帕黴素的結合物則在1994年才被發現。

Mike Hall和George Levi的研究小組在酵母中發現FKBP12的隱性突變導致了雷帕黴素的耐藥性，這為功能獲得模型和雷帕黴素屬於分子膠水的觀點提供了有力支援。登月艙的證據來自於DRR（dominant rapamycin resistant）和TOR（target of rapamycin）耐藥性等位基因區域的識別。

在與Crabtree利用CsA和FK506闡明鈣-磷酸酶-NFAT的訊號通路後，作者於1994年回到了雷帕黴素未完成的研究。Sabatini和Brown再次使用基於FKBP12-雷帕黴素親和層析法純化並表徵的FKBP12-雷帕黴素靶標作為未知蛋白激酶mTOR，確認了雷帕黴素像CsA和FK506一樣也是功能分子膠水。

20世紀80年代，細胞內訊號傳導、蛋白磷酸酶和蛋白激酶被認為是不可用藥的靶點。由於發現現有的藥物CsA透過抑制一種蛋白磷酸酶來阻斷細胞內訊號轉導，因此前兩種被認為是神話。3年後，隨著mTOR抑制劑西羅莫司/雷帕黴素的批准，蛋白激酶將從不可用藥名單中取消。2020年隨著大環內酯WDB002的發現，科學家拓展了自然使用FKBP12作為指令模組和聚酮化合物的生物合成路徑作為分子膠水來源的知識，FKBP12-WDB002可以結合CEP250幾乎沒有特徵的盤狀表面，如圖1所示。不可用藥的神話也被打破。

圖1：分子膠水發現時間線

03 有目的分子膠水

20世紀90年代早期有了這種小而強大的分子膠水後，科學家開始回答有關鄰近性在訊號傳導過程中的作用。蛋白質支架和小分子膠水的發現表明大自然利用鄰近性普遍存在，如圖2所示。作者受到Crabtree的啟發，設計出了首個針對基因融合的“雙功能“分子膠水，理論上它可以誘導任意兩個蛋白質接近，這些蛋白可以遺傳地附加到FKBP12或其他小分子結合模組上。化學鄰近誘導劑（chemical inducer of proximity，CIP）由一步烯烴複分解反應結合兩個FK506分子透過連線元素FK1012形成，如圖2Bi所示。FK-CsA正是在這樣的創新中發展起來，打開了使用任何不同基因融合的大門。

CIPs表明簡單地誘導細胞內部分鄰近足以引發一系列細胞後果的事件，如圖2Bi和2Bii所示。Rimiducid是第一個用於人體測試的有人工目的合成的分子膠水，結果表明骨髓移植患者透過誘導其死亡受體融合靶的二聚化從而消除移植物抗宿主病，導致靶向細胞消融。利用分子膠水誘導鄰近蛋白關聯，基因表達和抑制、染色質甲基化和重構、細胞器和膜定位、蛋白質降解可以被輕微地控制。

04 非天然分子膠水

1996年，Deb Hung等人發現了天然產物圓皮海綿內酯（discodermolide），它可以穩固α和β微管蛋白單體的結合。這些化合物的作用並不是誘導新結合，而是穩定微管。然而，這些“分子鉗”的潛在機制與化合物誘導新結合有關。2000年發現一種簡單的合成化合物也可以誘導天然蛋白的結合，為這一領域開闢了新的方向。

到目前為止，我們所遇到的分子膠水只是以自然產物膠或其衍生物的形式迅速增長。它們以CIPs的形式連線在一起，混合搭配，但構建的基石總是天然的。小分子篩選發現synstab-A（合成穩定劑）的“現成”合成化合物促進了微管在體外和細胞中的形成。因此，即使是簡單的非天然化合物也能誘導蛋白質結合。在這一發現後的數年時間裡，針對天然蛋白分子膠水和分子鉗的發現出現了爆炸式增長。

簡單的小分子可以作為分子膠水，當你考慮到轉錄後修飾可以誘導蛋白質關聯,就像一個錯義突變安裝一個不同的氨基酸可能完全改變蛋白質的樣子和它的相互作用組。分子膠水只是這些天然模組的非共價延伸。

另一個催化步驟是由免疫調節藥物（IMiDs）薩力多胺（thalidomide）和來那度胺（lenalidomide）以及抗癌藥物indisulam的作用機制（MoA）研究轉向合成分子膠水。這些小分子誘導E3連線酶和靶向蛋白的聯絡。更普遍的是，對含有或不含化合物的蛋白質靶標進行的細胞下拉實驗顯示，它們的靶標相互作用的變化頻率高得驚人。合成化合物常常起分子膠的作用，遠非自然選擇的專屬領域。

圖2：分子膠水誘導蛋白質接近

05 意 義

與細胞質訊號傳導和核染色質訊號傳導等生物學資訊傳遞手段類似，誘導蛋白的觀念為藥物開發帶來了希望。當小分子與蛋白質結合時，它們通常改變它們的相互作用。假定在一個細胞中蛋白質有多個結合物件，小分子有能力改變蛋白質表面的佈局，從而改變平衡，有利於不同蛋白質的結合。其結果包括增加（穩定劑）或減少（降解劑）靶標的壽命，改變其定位（矯正器），或啟用訊號，又或者基因表達。蛋白質和小分子間的相互作用使得藥物治療靶標範圍更廣，這些特徵為分子膠水的前景奠定了基礎。

我們已經知道分子膠水是有效的藥物，它在治療人類急性白血病中顯示出控制小分子敏感等位基因的活性，並且是最引人注目的探針之一。利用分子膠水降解劑和PROTACs降解治療靶標的新方法在新興製藥和生物技術公司中出現，藥物發現過程正在被重塑。

06 未來

新型基因工具正在引導合成生物學家設想透過基因編輯技術等方式來重新佈局細胞迴路。而分子膠水可以讓我們想象未來細胞電路可以在蛋白質水平上重新佈局。除了使用分子膠水誘導新蛋白相互作用和調節藥物靶標外，新型分子鉗可以穩定蛋白動態結合。化學生物提供了一種手段可以發現分子膠水，它可以把蛋白質從複合物中取出來，並引導它們到新的化合物中去。這為干預和理解細胞迴路提供了一種新的方式，並將其轉化為全新的治療方法。

參考資料

The Rise of Molecular Glues. Cell ( IF 38.637 ) .Pub Date : 2021-01-07 , Stuart L. Schreiber.

DOI: 10.1016/j.cell.2020.12.020