首頁>科學>

文章開始前呢,先回答一下非編碼RNA研究3問:

1.非編碼RNA只有miRNA、lncRNA和circRNA嗎?

2.非編碼RNA一定不編碼嗎?

3.miRNA一定降解靶基因的mRNA嗎?

你能答對幾個?

收藏下面這張表,祝您ncRNA研究一路上披荊斬棘。

隱藏在lncRNA中的編碼多肽可能是新的一類腫瘤標誌物和抗癌藥物靶標。

其實非編碼RNA編碼多肽或蛋白已經不是新鮮事了,感興趣的小夥伴可以聯絡我們推送更多專題文獻導讀。

該文章2020年發表於Nature Communications雜誌(IF 12.121),題為“An oncopeptide regulates m6A recognition by the m6A reader IGF2BP1 and tumorigenesis”(一種大環肽調節m6A讀取器IGF2BP1對m6A的識別與腫瘤發生的關係)

為方便理解,首先給大家總結下本文的思路導圖:

文字解讀:lncRNA LINC00266-1編碼產生的RBRP是RNA m6A閱讀分子IGF2BP1的調節亞基,透過調控m6A讀碼器,增加c-Myc的mRNA穩定性和表達,促使腫瘤的發生與發展。

學習總是枯燥的,修煉總是痛苦的,收藏以後寫標書的時候慢慢看喲!

0.前期研究

目前研究發現具有編碼功能的LncRNA都必須與核糖體結合,所以作者對SW480和SW620細胞的核糖體結合RNA進行測序,得到了384個有差異表達的核糖體結合LncRNA,再透過軟體分析,找出了55個具有編碼潛力LncRNAs差異表達。

1.發現了一個具有編碼功能的lncRNA:LINC00266-1

透過預測作者篩選了10個LncRNA,將10個lncRNA的ORF-GFP Mut構建體轉染到HeLa細胞中,檢測GFP熒光。只有lncRNAs LINC00266-1和FLJ20021的ORFs能夠被翻譯(圖1.a)。透過對LINC00266-1的分析,作者發現了一個213個核苷酸的短ORF,參與編碼了71-aa肽,將其命名為RBRP。透過序列比較,表明RBRP是一個未被鑑定過的肽。

作者用RBRP-Flag融合肽在LINC00266-1 ORF- flag (ORF)-和5'UTR-ORF-Flag (5'U)-轉染的細胞中大量表達,而LINC00266-1中起始密碼子ATG (5'UTR-ORFmut-Flag, MT)的突變破壞了ORF的翻譯(圖1.b-c)。

再將LINC00266-1 ORF-GFPmut融合構建體轉染到HEK293T細胞中,使用GFP抗體免疫沉澱RBRP-GFP融合肽,質譜鑑定在RBRP肽中檢測出兩個獨特的肽片段(圖1.d)。

圖一作者篩選出了一個lncRNA LINC00266-1,可以編碼RBRP肽,該肽尚未被鑑定過,其功能是未知的。

發現新東西了,它來了它來了,它帶著文章走來了!

2.既然發現了一個未知的肽RBRP,那就研究研究它到底有什麼功能吧!

作者分別透過免疫熒光、免疫組化與WB實驗,對各類癌症組織中RBRP的表達情況進行了對比分析,發現RBRP是:

自然的(Natural)

內源性的(Endogenous)

廣泛的(Widespread)表達於各種細胞和組織的肽。

並且RBRP在高度轉移性癌細胞亞系原發癌組織中表達水平顯著增加。(圖2.a-e)

為什麼要做這些鑑定呢?因為只有自然存在且內源表達豐富的東西才能作為診斷或治療的靶點呀!

隨後,作者透過Kaplan-Meier生存分析顯示,RBRP水平較高的結直腸癌患者的癌症相關死亡風險高於RBRP水平較低的患者,並且高RBRP水平與結直腸癌患者不良預後之間存在顯著的相關性(圖2.f-g)。總的來說,圖二就是論證了RBRP可能是一個潛在的致癌基因。

3.既然RBRP是lncRNA編碼出來的,那它們倆到底是誰!做了“惡人”呢?

要研究lncRNA LINC00266-1有沒有直接致癌作用,作者透過shRNA直接把其敲低,透過腫瘤細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲檢測發現:敲除LINC00266-1後,細胞生長、集落形成、遷移和侵襲顯著減少,而新增ORF(開放閱讀框,是可以編碼的區域)表達後這些改變恢復到對照水平,Mut組沒有恢復。這表明:RBRP肽,而非lncRNA LINC00266-1本身(要編碼出RBRP才行),才可以促進腫瘤發生。(圖3.a-d)

細胞水平做完,作者又在動物水平中做了一遍,結果同樣是恢復組有癌細胞增加,而Mut組沒有改變(圖3.e-g)。總的來講,圖3就是發現由lncRNA LINC00266-1產生的RBRP肽發揮了致癌作用,而不是LINC00266-1 lncRNA本身,RBRP在體外和體內均促進了腫瘤的發生和轉移。

這一記研究非編碼RNA編碼多肽的招數,你學廢了嗎?

4.既然排除了lncRNA LINC00266-1,抓到了RBRP,那就看看和它互作的蛋白有沒有什麼可以深挖的點吧。

Co-IP拉下來走一遍質譜,和RBRP互作的蛋白就都出來了。作者發現有一個蛋白IGF2BP1排在了前5。雙向Co-IP證明它倆的相互結合關係。首先用RNaseA酶排除RNA中間體的關係,再用截斷式Co-IP發現RBRP結合於IGF2BP1 KH3-4雙結構域(圖4.a-f)。

所以作者在KH3-4雙結構域中將GxxG突變為GEEG就完全消除了RBRP與IGF2BP1的相互作用。G19而非G19突變成A破壞了RBRP與IGF2BP1的結合,表明RBRP中的G19殘基對於IGF2BP1結合是必不可少的(圖4g-j)。總之,作者在圖4中發現並論證了:

RBRP可以結合到RNA m6A解讀器IGF2BP1上,此發現將RBRP與m6A甲基化掛上了鉤!

5.那又到底是RBRP還是 lncRNA LINC00266-1增加了IGF2BP1對m6A的修飾呢?

之前有研究表明IGF2BP1透過與編碼區不穩定決定因子(CRD)結合穩定c-Myc mRNA,所以作者以c-Myc CRD為檢測標準,透過RNA pulldown、RIP-QPCR、dot blot實驗對比lncRNA LINC00266-1NC/ORF/MT組,驗證是:RBRP增加了IGF2BP1與m6A修飾的c-Myc mRNA CRD的結合(圖5a-c)。

根據圖4i-j圖的結論(RBRP中的G19殘基對於IGF2BP1結合是必不可少的)進行進一步研究,作者發現G19A突變體沒有增加內源性IGF2BP1與m6A甲基化的c-Myc CRD的結合,這些結果表明:RBRP透過其G19殘基增加IGF2BP1與m6a修飾的c-Myc CRD mRNA的結合(圖5d-g)。

同時RIP-qPCR實驗表明,當沉默m6A寫入蛋白METTL14的表達,細胞內RNA m6A水平降低時,RBRP過表達誘導的內源性IGF2BP1與c-Myc CRD RNA結合的增強顯著受損,說明RBRP不會增加IGF2BP1對m6A修飾的c-Myc CRD突變體的識別(圖5h-i)。所以,圖5結論:是RBRP,而不是lncRNA LINC00266-1本身,增強了m6A的識別和m6A閱讀器IGF2BP1在RNA上的結合,如c-Myc mRNA。

6.排除干擾後,那就可以仔細盤算盤算RBRP是透過什麼方式來增加c-Myc mRNA的穩定性和表達的了。

作者透過比較c-Myc mRNA的穩定性,再次排除lncRNA LINC00266-1的干擾,證明是RBRP增加了c-Myc mRNA的穩定性,以及c-Myc mRNA和蛋白水平(圖6a-c)。

IGF2BP1的干擾阻斷了RBRP過表達引起的c-Myc mRNA穩定性增強(圖d)。

隨後從編碼器METTL14入手,敲低後發現RBRP過表達對c-Myc mRNA穩定性的增強作用被消除,而c-Myc CRD 突變顯著取消了RBRP過表達引起的c-Myc mRNA穩定性增強和c-Myc mRNA和蛋白水平升高。這些結果都表明:RBRPc-Myc CRD mRNA m6a依賴的方式增加了c-Myc mRNA的穩定性(圖6e-h)。

隨後又透過對臨床樣本的檢測,發現c-Myc水平與RBRP 致癌肽水平呈正相關(圖6i-j)。總之,圖6說明:RBRP透過加強IGF2BP1對c-Myc CRD mRNA的m6A識別和招募RNA穩定劑到m6A甲基化的- c-Myc CRD mRNA,從而提高了c-Myc mRNA的穩定性。

7.進一步研究RBRP是否IGF2BP1結合依賴的方式促進腫瘤的發生和c-Myc mRNA的穩定性

最後,作者透過設定NC、sh266、sh266+NC、sh266+WT、sh266+G19A組,發現干擾LINC00266-1可顯著降低c-Myc mRNA的穩定性和表達水平,細胞生長,集落形成,遷移和侵襲,與WT RBRP共轉染細胞中這些改變恢復到對照水平,與RBRP G19A共轉染細胞中無顯著改變。圖7論證:RBRP透過結合IGF2BP1促進腫瘤發生和c-Myc mRNA穩定性。

總結

本文的亮點有三:

1.發現了之前註釋過的lncRNA LINC00266-1實際上編碼了一種未標記的肽RBRP,該肽在腫瘤發生過程中具有致癌作用。這一發現改變了人們對於非編碼RNA無法編碼蛋白的傳統認知,為今後對非編碼RNA的研究打開了新的思路。

2.發現了RBRP可以與m6A編碼器IGF2BP1結合,結合後與YTH結構域家族蛋白促進mRNA降解不同,而是使 mRNA 更加穩定。

3.發現透過RBRP與IGF2BP1的結合,增強了m6AIGF2BP1對RNA的識別作用,如C-Myc基因,透過增加C-Myc的穩定性和表達,從而促進腫瘤發生。

Over!

9
最新評論
  • mRNA疫苗可誘導對SARS-CoV-2及其多種擔憂的變體的持久免疫記憶
  • Peter Bruce教授:原位液態電鏡揭秘富氟SEI功效