本週，賓夕法尼亞大學Jason Burdick課題組在Nature Communications上發表了題為“3D bioprinting of high cell-density heterogeneous tissue models through spheroid fusion within self-healing hydrogels”的文章。

摘要：需要細胞模型來研究人體發育和體外疾病，並篩選藥物的毒性和功效。當前的方法在功能組織模型的工程設計中受到限制，這些模型具有必要的細胞密度和異質性以適當地建模細胞和組織行為。在這裡，研究者開發了一種生物列印方法，可將球狀體以高解析度列印到自愈支援水凝膠（懸浮膠）中，從而使其圖案化並融合到規定空間組織的高細胞密度微組織中。該種方法生物列印的誘導多能幹細胞衍生的心臟微組織模型，可實現對心肌細胞和成纖維細胞比值控制，以複製心肌梗塞後出現的瘢痕性心臟組織的結構和功能特徵，包括收縮力下降和不規則的電活動。將生物列印的體外模型與功能讀數結合，以探究各種促再生microRNA治療方案如何影響組織再生以及由於心肌細胞增殖而恢復的功能。該方法可用於一系列生物醫學應用，包括開發精確模型以模擬疾病和篩選藥物，特別是在高細胞密度和異質性很重要的情況下非常有意義。

列印方法：為使可控的球狀體圖案化，開發了一種在自愈支援水凝膠內生物體化球狀體的方法，該方法包括：（i）真空抽吸介質儲器中的球狀體，（ii）將球狀體直接轉移至由於其剪下變稀特性而支援水凝膠（懸浮膠），以及（iii）球狀體在水凝膠中的任何位置沉積，並具有真空去除功能和水凝膠的自修復功能（圖 1a ）。透過在兩個容器之間進行球體運輸的狹窄通道，將包含球體的培養基容器與包含支援水凝膠的第二容器分離，可以實現此過程。該方法避免了當在液體和空氣介面之間轉移細胞和球體時可顯著降低細胞生存力的表面張力效應。所用的載體水凝膠是基於用金剛烷（Ad）或β-環糊精（CD）修飾的透明質酸（HA）的組裝物，其剪下稀化和自我修復特性如下所示：水凝膠粘度隨剪下速率的增加而降低，並在高應變到低應變的迴圈中恢復了儲能模量（圖 1b）（Burdick組已經基於此種材料發表多篇文章，感興趣的可以去調研瞭解）。

列印後24小時內評估了球體中細胞的活力。在較低的聚合物濃度（3和5 wt％）下，發現細胞活力高（90–95％），而在最高的聚合物濃度（7 wt％）下，細胞活力顯著下降（87％）。較低的聚合物濃度可能會降低球體平移過程中剪下力的影響，從而提高細胞活力。由於在所有聚合物濃度下均具有較高的生物列印精度，並且在低聚合物濃度下具有最高的細胞活力，因此3 wt％的水凝膠用於所有後續研究。

當球狀體透過直接接觸進行生物印刷時，在培養的四天中觀察到融合（圖 3b ）。另外，當以50 µm的分離距離對球體進行生物列印時，觀察到可比較的融合水平（圖 3b）。利用這些特性，接下來將8個球狀體沉積成環形，在培養4天后可將其連續融合成微組織環（圖 3c）。可以用多層球體重複此過程，以形成微組織管（圖 3c）。重要的是，由於支援水凝膠中交聯的非共價和可逆性質以及柔軟的水凝膠機械效能（G'〜150 Pa），因此可以輕輕吸去支援水凝膠以從融合的微組織中去除。

準確複製心臟疾病病理生理學的工程組織模型是一個領域挑戰。幾乎所有心臟病都涉及由CF增殖和ECM沉積引起的病理性纖維化重塑。CF本身無法產生動作電位，並且過多的ECM產生會減少心肌細胞-心肌細胞（CM）的連通性，從而導致組織順應性降低和電同步。MI後發生的局灶性心臟纖維化是主要的臨床負擔，通常會導致一系列病理重塑，並可能導致心力衰竭。工程組織模型可以複製這些病理特徵的各個方面並允許研究修復機制，可以為開發治療性干預措施提供有價值的工具。

為了滿足這一需求，研究者使用球狀生物列印技術設計了一種局灶性心臟纖維化的簡化模型。為了模擬健康和纖維化的心臟組織，透過將iPSC衍生的心肌細胞（iPSC-CMs）和CFs以不同的比率（“健康”的iPSC-CM與CFs的比例為4：1；將iPSC-CMs與CFs的比例為1：4）製成球狀體CF為“疤痕”），這透過對心臟肌鈣蛋白T（cTnT）（CM標記）和波形蛋白（CF標記）的免疫熒光染色進行了驗證（圖4a）。iPSC-CM是用於心臟球體研究的常見CM來源。對α-肌動蛋白的免疫熒光染色還顯示出健康球體中牢固的肌節形成，而瘢痕球體中的染色有限。與3天的疤痕對照組相比，健康的球體的收縮幅度顯著增加，並且趨向於更快的峰間時間〜850 ms（〜70 bpm）（圖4b）。光學對映細胞內Ca 2+顯示健康球體中的Ca 2+通量穩定且同步，而在瘢痕球體中僅觀察到較低水平的Ca 2+通量，且僅散在的零星島。量化了心臟細胞週期的關鍵引數，包括鈣瞬變持續時間（CTD）（ms），峰峰值時間（ms）和鈣通量幅度（F/Fo）。健康球體的CTD和鈣通量振幅顯著較高（圖4c），健康球體的峰值時間顯著降低（即更快的去極化）（圖4c）。總之，這些結果表明，心臟球體中CM：CF比率的變化允許建立健康和疤痕累累的心臟組織模型。

為了模擬局灶性心臟纖維化，作者使用了生物列印技術，透過健康和疤痕狀球體的定向融合來建立心臟組織的異質環。環形結構用於模擬心腔的組織水平電生理特性，包括再次出現心律不齊的可能性。為了對健康的心肌建模，對直接接觸的8個健康球體的環進行了生物列印，而對有疤痕的心肌模型進行了7個健康球體和1個瘢痕性球體的環的生物列印（圖5a）。培養5天后，對cTnT和波形蛋白雙重染色證實了相鄰球體之間的融合，並且在疤痕微組織中觀察到了高成纖維細胞密度的區域。活死染色顯示融合5天后具有高細胞活力，並且iPSC-CM與CF的比例在培養期間保持不變。在微組織的健康區域也觀察到了健壯的肌節染色，在疤痕區域觀察到了較低的水平。另外，連線蛋白-43在細胞邊界處的染色表明在微組織的健康區域中間隙連線的形成，而在疤痕區域中發現的染色水平較低（圖5a）。微組織環也以連續和同步的方式收縮，從支援水凝膠中取出後可以觀察到（圖5b）。微組織收縮的定量揭示了與健康對照組相比，疤痕微組織收縮幅度減小的趨勢（圖5b），模仿了心肌梗死後整體收縮力的降低。

為了確定miRNA處理是否能促進瘢痕狀球體中CM和CF的增殖，我們在7天時進行了EdU標記（一種增殖標記）以及cTnT和波形蛋白染色的共染色（圖6b）。存在cTnT+EdU+島，表明增殖和克隆擴增（圖6b），尤其是治療時間較長（0-4天，0-7天）的情況。沒有觀察到Edu+細胞的數量增加，表明miRNA處理主要影響CM增殖。在健康的球體中也觀察到類似的趨勢，隨著cTnT數量的增加與對照組相比，在所有治療條件下均觀察到Edu+細胞，對CF增殖的影響有限。

生物列印技術的進步使得能夠開發出能夠更好地模仿天然組織和器官複雜性的體外模型和可植入結構。這些技術中的許多技術都依賴於處理嵌入水凝膠中的細胞懸浮液，這給工程改造具有天然組織樣細胞密度和異質性以及所產生功能的組織帶來了挑戰。在這裡，研究者開發了一種能夠對高細胞密度組織模型進行3D生物列印的過程，並且可以精確控制微組織結構和區域性異質性。這可以透過應用自愈水凝膠來實現，該凝膠支援3D空間中生物列印的球體的生物組裝和融合，以形成連續的細胞密集的組織模型。透過對心臟微組織疾病模型進行生物列印來證明該方法的潛力，該模型概括了MI後出現的病理性瘢痕形成特徵，並使用心臟功能的讀數（收縮，電生理同步），能夠探查修復的miRNA治療方法。該方法具有很高的通用性，可與各種球體和類器官系統一起實施，這為精確模型的3D生物列印提供了許多機會，以模擬疾病和進行藥物篩選。

Daly, A.C., Davidson, M.D. & Burdick, J.A. 3D bioprinting of high cell-density heterogeneous tissue models through spheroid fusion within self-healing hydrogels. Nat Commun 12, 753 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21029-2