【科研摘要】
最近,伊利諾伊大學香檳分校Chen Wang博士/Ralph G. Nuzzo教授團隊在《Advanced Functional Materials》上發表了題為3D Particle‐Free Printing of Biocompatible Conductive Hydrogel Platforms for Neuron Growth and Electrophysiological Recording論文。他們論述了導電3D週期微支架是使用無顆粒直接墨水書寫方法制造的,用作神經元生長和電生理記錄平臺。聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)/吡咯油墨,然後進行吡咯的化學原位聚合,可以透過小至1 µm的噴嘴進行水凝膠列印。這些導電水凝膠可對複雜的2D和3D結構進行圖案化,並與測試細胞培養物具有良好的生物相容性(7天后的活力約為94.5%)。水凝膠陣列促進廣泛培養的加州Ap腳踏板神經節神經元的神經突生長。該平臺允許細胞外電生理記錄穩態和刺激的電神經元活動。總而言之,這種3D導電油墨列印工藝能夠製備生物相容性和微米級的結構,以建立定製的體外電生理記錄平臺。
【圖文解析】
2.1導電水凝膠的列印和表徵
設計用於直接墨水書寫的新墨水,使其能夠製造具有細胞大小尺度特徵尺寸的電生理凝膠平臺。這種可列印材料由乙醇水溶液中各種分子量的pHEMA鏈與吡咯共聚單體的物理纏結聚合物網路組成。圖1示意性地說明了這種成分和製造順序,以獲得導電凝膠支架。對pHEMA均聚物的含量進行了最佳化,以滿足直接墨水書寫的流變要求和適用於細胞培養研究的功能性凝膠複合材料的要求。聚合物網路設計在列印過程中將吡咯單體限制在水凝膠基質中,隨後用氯化鐵進行處理會引起原位聚合並摻雜生成的互穿聚吡咯。在處理後數分鐘內,列印的水凝膠從無色透明變為深黑色,可見聚合和摻雜。充分漂洗列印的圖案,然後每4小時浸入去離子水中,每4小時進行4次水交換,以除去未反應的單體。由於這種微細加工工藝使油墨列印與原位導電顆粒形成分離,因此可以獲得微米級的特徵寬度。導電細絲的輕鬆,無堵塞擠壓可實現複雜的3D結構形成(如圖2所示)。
圖1 不含導電顆粒的水凝膠的形成示意圖。頂行表示列印結構的宏觀檢視,而底行表示水凝膠形成三個階段的精細結構。下排圖片中的綠線表示聚HEMA鏈,黃色三角形表示吡咯單體,棕點表示吡咯低聚物,黑點表示聚吡咯顆粒。
圖2 水凝膠油墨的特性包括其流變行為和形成穩定結構的能力。a)墨水儲存模量(G')和損耗模量(G'')在1Hz頻率下以振盪模式在1Hz下測量,顯示出墨水具有類似液體的響應。b)測得的油墨粘度是剪下速率的函式,並顯示了3D列印所需的剪下稀化特性,黑線顯示了剪下稀化指數。c)使用1 µm尖端列印的圖案的透射光光學顯微鏡影象證明了使用小噴嘴進行可行的列印。d)列印的3D金字塔結構影象顯示墨水具有出色的3D可構建性,單絲用箭頭標記。
流變性質是影響3D微結構列印的重要因素。此處,油墨的流變功能和列印結構的示例如圖2所示。在流變學表徵期間,水凝膠油墨處於水合狀態,使用水和乙醇的溶劑阱來防止測量過程中的蒸發。優化了pHEMA-吡咯水凝膠油墨的彈性模量和粘滯模量,使油墨絲能夠跨越底層的縫隙,同時保持其形狀。
由列印的絲狀(脫水)結構製成的SEM分析(圖3a,b)揭示了固化步驟形成的PPy的一般形態特徵;這些顯微照片揭示了一個緊密滲透的奈米顆粒網路(圖3c,d)。pHEMA絲狀網路形成了更加分散的基質,該基質在物理上限制了複合材料水合狀態下的這種密集的奈米粒子種群。從結構的高放大倍數俯檢視判斷(圖3c),與純pHEMA薄膜和列印結構形成的邊界相比,這些奈米粒子使複合材料的表面明顯更粗糙。細絲結構的高解析度橫截面SEM影象表明,在細絲的整個內部域中都存在直徑≈100nm的PPy奈米顆粒(圖3d)。
圖3 印出的“ I”圖案的宏觀和SEM影象包括:a)印出的圖案具有1 mm比例尺的照片,b)從(a )用400 µm的比例尺,c)用100 nm的比例尺放大(b)中描繪的單條列印線的突出顯示區域的影象,以及d)導電水凝膠圖案的橫截面的SEM影象,其中 500 nm比例尺。
將使用電化學工作站測量的複合水凝膠的電導率與四點探針測量的結果進行比較(圖4a)。透過在PBS緩衝液中對Ag/AgCl進行多次CV掃描來探索水凝膠的電化學穩定性,如圖4b所示。複合水凝膠的電容行為和法拉第電流有助於提高電荷轉移效率,並最終在裝置/電池介面記錄訊號質量。作者還從宏觀角度評估了材料作為電導體的效能(圖4c,d)。在此,將複合水凝膠絲網列印並插入具有4.5 V LED光源和電源的電路中。該演示表明,當由5V DC施加的偏壓供電時,列印的圖案可以支援LED的發射。
圖4 導電水凝膠油墨的電和電化學特性。a)導電水凝膠薄膜的阻抗幅度隨頻率變化的I-V曲線和波特圖顯示出固有電導率為13.59 S cm-1,歸一化阻抗為8.4Ωcm2。b)PBS緩衝液中的導電水凝膠薄膜相對於Ag/AgCl的CV掃描結果(20個迴圈,掃描速度20 mV s-1)顯示聚吡咯的還原和氧化。c,d)當連線到以列印的水凝膠網作為導體並施加5V電壓的電路中時,LED點亮。響應於所提供的功率,LED的照明和變暗證明了水凝膠網的導電性。
2.2評價複合水凝膠的生物相容性
pHEMA和PPy都沒有細胞毒性的報道,已被廣泛用作各種生物分析應用中的活性和輔助材料。這裡展示的是新複合材料的直接生物相容性測試結果,表明該材料可用作基底以支援培養中細胞正常生長的模式,甚至促進有用形式的細胞從玻璃基底遷移並附著在列印導電絲上。在這些實驗中(圖5),將裝置滅菌後,將MC-3T3-E1前成骨細胞接種到帶有列印U型複合細絲的導電水凝膠薄膜或載玻片上(圖5a-d),如實驗中所述部分。在7天的培養期內,使用活/死分析評估了薄膜支援的培養物上的細胞活力,並在第1、3和7天對死(紅色)和活(綠色)細胞進行計數(圖5b,e) 。
圖5 導電水凝膠的生物相容性評估顯示出高存活率並促進細胞遷移。a)在水凝膠薄膜上進行的細胞培養實驗方案,其中b)在導電水凝膠薄膜上培養7天並用活/死分析法染色的成骨細胞的熒光影象。活細胞呈現綠色,呈死紅色。c)培養的細胞遷移到打印出的U形導電圖案上的方案,其中d)培養7天后細胞遷移到列印的細絲上的熒光影象,箭頭表示遷移方向。e)在第1、3和7天,水凝膠薄膜上的成骨細胞的存活率。f)導電水凝膠的表面電荷測量,以及在無聚吡咯的pHEMA水凝膠(黑色)和導電水凝膠(紅色)的PBS緩衝液中的參比。
2.3用於單個培養的神經元電生理記錄的基於導電墨水的平臺
墨水的電導率和生物相容性允許製造電生理記錄平臺,用於研究培養的神經元的電活動(圖6a)。圖6b描述了在記錄之前單元與列印陣列的兩種型別的互動。這些代表性的資料顯示了優選與陣列的複合水凝膠材料進行最大程度接觸的細胞相互作用的行為:較小的細胞傾向於以陣列細絲的頂部為中心,而較大的細胞更常見地跨越兩個相鄰的陣列細絲。像成骨細胞一樣,培養基中存在的帶正電的表面也不會抑制細胞附著,因此不需要額外的表面處理。圖6c顯示了從記錄和刺激組及其相應的控制裝置獲取的電生理記錄。與之形成鮮明對比的是,來自記錄和刺激組的訊號顯示了動作電位,具有來自記錄和刺激實驗的代表性單個尖峰(圖6d)。神經元與陣列的長期相互作用(圖6e)突出顯示了導電水凝膠的生物相容性,在培養5天后,神經元沿陣列的細絲大量向外生長。
【總結】
作者已經開發併成功測試了具有出色生物相容性和高空間解析度的3D可列印導電水凝膠油墨。微週期導電陣列已被製造並用作神經元細胞外訊號記錄平臺。證明了這種陣列有助於在穩態和刺激狀態下檢測神經元活動的能力。這種可程式設計的導電水凝膠為製造高空間解析度的平臺提供了新的機會,該平臺可以幫助研究包括神經元在內的不同電活性細胞的體外和體內活性。
參考文獻:doi.org/10.1002/adfm.202010246