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近年來，基於mRNA 的蛋白質替換療法和CRISPR/Cas介導的基因編輯在許多疾病的治療方面具有極大的應用前景【1-3】。特別是，莫德納和輝瑞-生物新技術公司開發的mRNA新冠疫苗近期已成功得到應用，Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A. Doudna博士因“CRISPR/Cas9基因編輯技術”獲得2020年諾貝爾化學獎。但是，安全有效的體內遞送仍然是制約基因治療應用的最大障礙。在RNA遞送領域，脂質奈米顆粒 (Lipid nanoparticles, LNPs) 成績突出。2018年FDA批准的第一款siRNA藥物 (Onpattro) 【4】 和以上兩款mRNA新冠疫苗【5,6】 均採用了LNPs遞送系統。雖然現有的研究工作已經取得了一些進展，但是我們仍然需要更加高效和智慧的體內遞送體系。尤其是，1) 目前最高效的LNPs體系，也僅有1% - 4%的RNA逃出內涵體，內涵體逃逸效能低【7】；2) 現有的LNPs大多具有肝臟靶向，肝臟以外其他器官的靶向、特異性遞送問題亟待解決【8】。
2021年2月4日，美國德克薩斯大學西南醫學中心Daniel J. Siegwart教授團隊 (共同一作為劉帥博士和程強博士) 在Nature Materials上線上發表了題為 Membrane destabilizing ionizable phospholipids for organ selective mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing 的研究成果，報道合成了一系列具有強內涵體逃逸效能的新型磷脂 (iPhos)。含有iPhos組分的LNPs (記為iPLNPs) 用於遞送mRNA或Cas9 mRNA/單向導RNA (sgRNA) 複合物，取得了極高的體內mRNA遞送和CRISPR/Cas基因編輯效率。並且，iPhos磷脂化學結構調控或者 iPLNPs 組分調控均可實現器官選擇性遞送。
LNPs通常由磷脂/陽離子脂質/膽固醇/聚乙二醇化脂質四組份組成，之前幾乎所有研究均集中在最佳化陽離子脂質結構上，而當下所用商業化磷脂種類和結構單一。但是磷脂具有其獨特的優點，磷脂與生物膜結構同源，具有很強的內涵體膜融合和內涵體逃逸潛力，因此透過化學手段靈活設計結構可控的新型磷脂，為獲得更加高效的LNPs系統提供了一個新的思路。作者推測由一個叔胺和一個磷酸基團組成的兩性離子頭部，結合一個帶有三條疏水烷基鏈的尾部，將有利於磷脂的內涵體逃逸 (圖1)。在酸性內涵體環境下，叔胺質子化，磷脂形成一個較小的兩性離子頭部和一個較大的多疏水鏈尾部，插入磷脂膜中形成一個錐形結構，促使膜向六方晶相轉變從而實現內涵體逃逸。而在中性生理pH下，整體帶負電的iPhos難以插入到內涵體膜中，保證了iPhos材料的低毒性。為了驗證這一理論，作者設計合成了572種iPhos 磷脂 (圖2)，其中包含各種兩性頭部和不同數量的疏水鏈尾部。體外構效關係結果和膜相轉變研究均有效支援了上述理論。
圖1. 新型磷脂iPhos有助於內涵體膜的相轉變，從而提高內涵體逃逸效能。
圖2. 572種iPhos的合成和體外mRNA遞送篩選。
接著，作者進一步進行體內mRNA遞送篩選。體內構效關係揭示出很有趣的結論， iPhos結構不僅影響體內轉染效率，而且可以控制器官選擇性 。結果證明：1) 包含一個可電離叔胺，一個帶負電磷酸基團和三個疏水烷基鏈的iPhos效率最高；2) 叔胺一側烷基鏈長度控制著體內mRNA遞送效率，8 ~ 10碳鏈長度iPhos體內效率最高；3) 磷酸基一側烷基鏈長度決定器官選擇性，9 ~ 12碳鏈長度的iPhos遞送mRNA至肝臟表達，13 ~ 16碳鏈長度的iPhos遞送mRNA至脾臟表達。這一有趣現象表明調控iPhos化學結構可以實現器官選擇性，對其它遞送體系的設計具有借鑑意義。
隨後，作者使用肝靶向的9A1P9-5A2-SC8 iPLNPs和肺靶向的9A1P9-DDAB iPLNPs進行了mRNA遞送和基因編輯的應用研究。作者選用了tdTomato (tdTom) 轉基因小鼠，當tdTom基因前的終止訊號被Cre酶或者CRISPR/Cas9 切除後會啟用紅色熒光蛋白的表達，便於檢測。作者對tdTom小鼠單次靜脈注射了包裹Cre mRNA的9A1P9-5A2-SC8 iPLNPs和9A1P9-DDAB iPLNPs，透過流式細胞儀測定了不同細胞型別的編輯效率。肝實質細胞的編輯效率高達91%，肺部內皮和上皮細胞的編輯效率分別達到34%和20%。這些結果為mRNA依賴的器官特異性治療提供了依據。
作者將器官靶向的iPLNPs進一步應用到CRISPR/Cas基因編輯，共遞送Cas9 mRNA和sgRNA。一次靜脈給藥後，肝靶向的5A2-SC8 iPLNPs和肺靶向的9A1P9-DDAB iPLNPs分別成功編輯了tdTom小鼠肝部和肺部，保持了器官特異性。接著，作者對iPLNPs靶向編輯內源性基因 (PTEN) 的能力進行了測試。在C57BL/6小鼠中，一次靜脈注射裝載有Cas9 mRNA和sgPTEN的iPLNPs後，不僅成功觀察到器官選擇性基因編輯，而且肺靶向9A1P9-DDAB iPLNPs對肺部的基因編輯效率更是高達28.3%。最後，作者驗證了iPLNPs體系的臨床轉化潛力：1) 用微流控技術大批次製備了iPLNPs，並且保持了高mRNA遞送效率和器官特異性；2) iPLNPs可以重複給藥，保持高轉染效率；3) iPLNPs體內毒性很低 。
總結而言，本研究開發了一系列易破膜新型磷脂，拓展了磷脂的種類和結構，拓寬了LNPs體系。證明了脂質化學結構的調控和奈米顆粒組分的調控均可實現器官選擇性，為下一代基因載體的開發提供了思路，將會極大地促進基於mRNA遞送和CRISPR/Cas基因編輯的器官特異性疾病治療研究。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41563-020-00886-0
製版人：十一
參考文獻
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