撰文 | 木蘭之枻

責編 | 兮

活細胞內的生物學事件呈現高度動態化的特徵，因此其發生和持續時間也難以藉助時鐘系統進行計算。因此，開發活細胞內適用的類時鐘系統對生物學研究有非常重要的意義。近年來，研究者正嘗試利用DNA來進行資料儲存【1,2】，甚至開發出DNA顯微鏡用於生物分子的空間定位分析【3】。DNA能否用來記錄細胞內生物學事件的時間資訊？目前還缺乏相關研究對此加以驗證。

2021年2月3日，來自韓國延世大學醫學院的Hyongbum Henry Kim實驗室在Cell發表題為Recording of elapsed time and temporal information about biological events using Cas9的論文。文章藉助於CRISPR-Cas9工具開發出一套可記錄細胞內生物學事件發生及持續時間的“DNA時鐘”系統，從而證實了利用DNA記錄時間資訊的可行性。

理論而言，Cas9對目標位點的編輯效率與時間存在相關性。研究者推測，在保證Cas9蛋白和gRNA表達穩定的前提下，目標位點的完整性應當呈現出指數式衰減的特徵。而後研究者利用Cas9定向整合的HEK293T細胞系和自我靶向的gRNA文庫（stgRNA文庫）系統證實了這一猜想。研究者又對目標序列的可測量時間視窗與序列完整性半衰期之間的關係進行分析。結果顯示，現有體系下，可測量時間視窗的跨度為半衰期的1/10~5倍，其中在半衰期的1~2倍時準確度最高。此外，由於stgRNA文庫對應著眾多目標位點，因此在計算生物學事件的時間資訊時，需要對各位點的估值進行綜合評估。研究者經過多重計算模擬和系統分析後指出，各目標位點估算時間的四分位數淨推薦值（nps）的加權平均值對時間資訊的預測準確度最高。隨後研究者還在各組重複樣本中證實了上述系統的準確性和可重複性。綜上可知，研究者構建出一套可記錄測量細胞內時間資訊的“DNA時鐘”系統。

為提升“DNA時鐘”系統的普適性，研究者從多個方面對其最佳化：文庫體量和細胞數目兩方面的研究指出，包含100~200條stgRNAs的文庫以及數萬細胞的體系便足以構建出高精度的“DNA時鐘”系統用於半衰期和時間資訊的記錄和測算。研究還證實，除Cas9定向整合的HEK293T細胞系外，不同型別的細胞系以及不同啟動子驅動的Cas9轉基因細胞系同樣可用於“DNA時鐘”系統的構建；當然，使用不同型別的細胞系以及不同的Cas9轉基因體系時，需要額外的“相對時間常數”對新的“DNA時鐘”系統進行校正，方能正確記錄和測算生物學事件的時間資訊。

此外，可靠的時鐘系統應儘可能的獨立於外界環境以免受干擾。研究者指出，不同的微環境中，無論是體外的2D培養體系，還是體內的3D培養環境，“DNA時鐘”系統均能保持較高的穩定性和準確度。研究者還證實，哪怕同時改變系統的細胞型別、微環境特徵以及Cas9的啟動子，“DNA時鐘”系統依然保持著相對的穩定性和準確度。最後，研究者還在細胞系和小鼠模型中對“DNA時鐘”系統的適用性進行驗證：在細胞系水平上，“DNA時鐘”能準確記錄化合物刺激細胞的持續時間，且時間精度可達小時級。此外，“DNA時鐘”還首次實現了細胞內生物學事件發生時間的準確測算。而在小鼠模型上，研究者同樣證實，“DNA時鐘”系統可以較準確的記錄和測算小鼠體內炎症的持續時間，以及用於炎症誘導的脂多糖（LPS）的注射時間。

總體而言，本研究利用CRISPR-Cas9系統的基因編輯特性，成功的設計出一套具有廣泛適用性的“DNA時鐘”系統用於記錄細胞內生物學事件的時間資訊。這一研究首次將DNA用於時間資訊的記錄，實現了概念上的創新；且“DNA時鐘”系統的出現對眾多生物學事件的研究有巨大的推動意義。雖然現有的“DNA時鐘”系統依然不甚完善，但其應用前景令人期待。

原文連結

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.014

製版人：十一

參考文獻

1. Koch, J., Gantenbein, S., Masania, K. et al. A DNA-of-things storage architecture to create materials with embedded memory. Nat Biotechnol 38, 39–43 (2020).

2. Erlich, Y. & Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Science 355, 950-954 (2017)

3. Weinstein, J.A., Regev, A., and Zhang, F. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction. Cell 178, 229–241.e16 (2019).