多巴胺（Dopamine，DA）作為大腦中重要的神經遞質，是一種用來幫助細胞傳送脈衝的化學物質。多巴胺調控運動、學習記憶、藥物成癮、腦老化等多種生理過程；帕金森病，精神分裂症，注意力缺陷多動綜合症和垂體腫瘤等多種疾病的發生多與多巴胺系統的調節障礙息息相關。因此，研究多巴胺在各種生理和病理過程中的作用尤為重要。

傳統測量DA動力學的技術，包括微透析，電化學探針和基於基因表達的分析等，往往缺乏足夠的時空解析度和/或分子特異性。因此，開發一種具有高時空解析度、高特異性和高靈敏性的感知DA濃度變化的新型工具將有助於我們研究多巴胺系統在生理和病理條件下的不同功能。

近期，北京大學李毓龍實驗室、紐約大學Dayu Lin實驗室和美國國立衛生研究院Guohong Cui實驗室在《Nature Methods》聯合發表了題為“Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究論文，報告了新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開發及在細胞、腦切片、果蠅和小鼠中的成功應用。

研究者在已發表的多巴胺探針基礎上進行改造和最佳化，開發出了新型的具有紅色熒光且可與其他綠色熒光探針共同使用的多巴胺探針（rGRABDA1m和rGRABDA1h），以及具有更高靈敏度及成像信噪比的第二代綠色熒光多巴胺探針（GRABDA2m和GRABDA2h）。

同時，對該探針在細胞、腦片、果蠅、小鼠中多巴胺動態的檢測進行了驗證，充分證明了新型多巴胺探針具有高特異性、高靈敏性及高時空解析度，並可與光遺傳學、鈣成像和電生理學等技術組合使用，為更深入研究多巴胺的生理和病理功能提供了重要工具。

部分研究結果

1、新型紅色熒光DA探針和第二代綠色熒光DA探針的研發及特性

① 新型紅色熒光DA探針

作者以多巴胺受體D2R和紅色熒光蛋白cpmApple為基礎，透過系統最佳化並從2000多個變體中篩選出了熒光響應最強的探針：rDA0.5。隨後，作者透過引入突變先後在rDA0.5的基礎上生成了中親和性的rDA1m，在rDA1m的基礎上開發了對DA具有高親和性的rDA1h以及對DA訊號不敏感的對照rDA-mut。資料顯示，rDA1m、rDA1h及rDA-mut在HEK293T細胞膜上能良好表達，rDA1m和rDA1h的EC50（半數有效濃度）分別為95 nM和4 nM；用100 μM DA處理時，rDA1m和rDA1h熒光響應（ΔF/F0）分別約為150%和100%，並可被D2R拮抗劑氟哌啶醇（Halo）阻斷，而表達rDA-mut的細胞未產生熒光響應。

研究表明在藍光照射下，基於cpmApple的探針會發生光啟用，因而這些探針難以與ChR2聯合使用，如經藍光照射後基於cpmApple的紅色熒光鈣指示劑jRGECO1a熒光訊號上升約為25%，而rDA1m和rDA1h受到的干擾較小（熒光強度降低約10%），因此新型紅色熒光DA探針能夠與藍光介導的光遺傳啟用工具相相容。此外，與幾種常用的紅色熒光蛋白相比，新型紅色熒光DA探針在HEK293T細胞中的光穩定性更強（圖1）。

② 新型第二代綠色熒光DA探針

與此同時，作者在第一代綠色熒光DA探針（DA1m和DA1h）的cpEGFP模組引入隨機突變，最佳化並篩選出高親和力的綠色熒光DA探針——DA2h ，並先後生成了中等親和力的DA2m和對DA訊號不敏感的DA-mut對照探針。與對應的第一代DA1m和DA1h探針相比，最佳化後的第二代DA探針DA2m和DA2h對100 μM DA的熒光反應強度增加了2~3倍，對應的EC50分別為90 nM和7 nM（圖1）。

圖1. 新型紅色熒光DA探針和第二代綠色熒光DA探針的研發及特性

特異性

新型DA探針熒光訊號均可被D2R拮抗劑Halo和Etic特異性阻斷，但不會被D1R拮抗劑SCH-23390阻斷，並且四種DA探針對其它幾種神經遞質和神經調節劑的熒光響應基本可忽略不計。此外，去甲腎上腺素（NE）與DA結構相似，但是新型DA探針對DA的親和性是NE的10-20倍，表明新型DA探針對DA具有高度特異性。

動力學

4種DA探針的響應時間常數τon 均小於100 ms，亞秒級動力學。

與下游訊號通路的耦合度

當在HEK293T細胞中表達時，rDA1h和DA2h幾乎不與下游訊號通路耦合；對錶達探針的大鼠皮層神經元和轉基因果蠅進行1~2 h的成像，未觀察到熒光強度有顯著下降，表明新型DA探針與下游訊號通路的耦合度極小。此外，在培養的神經元中表達時，新型紅色和綠色DA探針均易定位在細胞膜上，且對DA響應極好，表明新型DA探針可有效應用於神經系統。

綜上所述，新型紅色和綠色DA探針對DA動態的檢測具有高度的靈敏性和特異性，且具有快速動力學，適用於體內多巴胺活性的檢測（圖2）。

圖2.新型DA探針在HEK293T細胞和大鼠皮層神經元中的表達特性

2、新型DA探針測定小鼠腦切片中DA的動態變化

接下來，作者對新型DA探針是否可用於測定小鼠腦切片中內源性DA的釋放進行了驗證：分別用表達rDA1m、rDA1h和DA2m的AAV（維真生物提供，400 nL/位點）侵染小鼠伏隔核（NAc），兩週後檢測DA訊號。資料顯示逐漸增加的電刺激誘導了NAc熒光響應的不斷增強，並可被D2R拮抗劑Halo阻斷。

為了測定紅色熒光DA探針是否與綠色熒光鈣探針相容，作者在小鼠中腦腹側被蓋區（VTA）表達了軸突靶向的GCaMP6s，並在NAc區表達了rDA1m，給予電刺激並對NAc區的鈣訊號和DA訊號同時成像。資料顯示，電刺激誘發了GCaMP6s和rDA1m熒光響應的強烈增加，並且二者增加的幅度高度相關；此外，Halo可阻斷rDA1m的熒光響應，而對GCaMP6s的訊號無影響。

上述結果表明，rDA1m、rDA1h和DA2m探針可檢測腦切片中多巴胺能的動態變化，同時新型紅色熒光DA探針可與綠色熒光探針相容，同時進行雙色成像（圖3）。

圖3.新型DA探針可用於測定小鼠腦切片中DA的動態變化

3、新型DA探針測定自由活動小鼠體內DA的動態變化

作者又驗證了新型DA探針是否可用於測定自由活動的動物體內多巴胺的動力學。透過在小鼠黑質緻密部（SNc）和背側紋狀體分別表達光遺傳工具C1V1和DA探針，測量小鼠背側紋狀體的DA動力學。研究發現，SNc中多巴胺能神經元的光啟用使小鼠背側紋狀體的DA探針產生了強烈的熒光瞬時增加，同時該訊號可被DA轉運蛋白（DAT）阻滯劑哌醋甲酯（MPH）延長，被D2R拮抗劑依替必利（Etic）阻斷。因此，新型DA探針可以高靈敏、高特異性檢測自由移動的小鼠體內由光基因誘導的DA釋放（圖4）。

圖4.GRABDA探針可以檢測光基因誘導的小鼠黑質紋狀體中DA的釋放

4、新型DA探針測定小鼠交配行為中DA的動態變化

①將AAV-hSyn-DA1h和AAV-hSyn-DA2h分別表達在小鼠NAc的兩側，發現在小鼠交配行為中DA1h和DA2h訊號在時間上高度相關，而且第二代DA探針DA2h探針在各交配階段的熒光響應變化明顯高於第一代DA探針DA1h。

②將AAV-hSyn-rDA1m和AAV-hSyn-DA2h共注入NAc中，雙色光纖記錄顯示在小鼠交配行為中rDA1m的熒光動態變化小於DA2h， 但rDA1m和DA2h檢測的DA動態變化是一致的，在時間上也高度相關。此外，新型紅色和綠色熒光DA探針之間無交叉干擾。

上述結果表明在小鼠交配行為中新型紅色和綠色熒光DA探針檢測到的DA動態變化高度一致。

圖5.新型DA探針測定小鼠交配行為中NAc腦區的多巴胺動態變化

小結

新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針可用來測量小鼠腦切片、果蠅和自由移動的小鼠體內DA的動態變化，具有高特異性、高靈敏性和高時空解析度，還可與光遺傳學、鈣成像和電生理學等技術結合使用。新型DA探針不僅為多巴胺的功能研究提供了重要工具，也為將來開發具有多種光譜範圍以及更高信噪比的神經遞質探針提供了寶貴經驗。