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撰文 | 木蘭之枻

責編 | 兮

以細胞內RNA為靶標的生物學研究是在DNA靶向研究興盛之後起步，並於21世紀初有所突破。這其中的兩大突破，一是MS2噬菌體的衣殼蛋白（VCP），其結合特定RNA莖環結構的能力被廣泛用於細胞內mRNA的成像和穩定性調控；另一則是RNA干擾（RNAi）技術，其高效特異性抑制基因表達的能力使之成為RNA功能研究的利器。此後的十數年裡，VCP和RNAi引領潮流，而新的技術也不斷湧現，為RNA靶向研究帶來無限活力。這其中，RNA靶向的CRISPR系統（RCas）因其巨大的潛力引來眾人關注。

就其本源而言，CRISPR系統是原核生物抵抗外源病毒及噬菌體入侵的獲得性免疫系統。其基本原理是Cas蛋白與嚮導RNA（crRNA）形成複合物，進而結合並破壞與嚮導RNA互補的靶序列。根據系統的不同，其靶序列可以是雙鏈DNA（dsDNA），也可能是單鏈DNA（ssDNA）或單鏈RNA（ssRNA）。總體而言，CRISPR系統可以分為兩大類，1類系統的功能性複合物需要多個Cas蛋白的參與；2類系統則只需要單一的Cas蛋白參與。考慮到系統的便捷性，研究者更多的關注於2類系統的改造，並在研究初期多用於DNA靶向研究和基因組編輯並取得了豐碩成果。

在DNA靶向研究取得諸多進展之後，考慮到CRISPR系統亦有靶向RNA的能力，研究者開始關注於RCas系統的發掘與改造，從而推動了RNA靶向研究的飛速發展。前不久，來自美國加州大學聖迭哥分校（UCSD）細胞與分子醫學系的Gene W. Yeo博士在Nature Cell Biology發表題為RNA-targeting CRISPR systems from metagenomic discovery to transcriptomic engineering的綜述。文章對RCas系統的研究進展進行了梳理，從RCas系統的篩選、改造和應用等多個方面加以歸納總結，這對我們系統性的認識RCas系統有重要幫助。此外，研究者也指出了該領域面臨的困難和挑戰，從而為未來研究提供了思路和見解。

作者首先對RCas系統的篩選、驗證及種類進行了總結（圖1a）。目前應用最廣泛的RCas系統可以分為兩大類，一類是對DNA靶向的CRISPR系統進行改造，從而實現了對RNA的靶向和調控，但這類改造的系統仍有不盡人意之處。另一大類則是特異性識別ssRNA的CRISPR系統，這類RCas系統的發現主要依賴於以生物資訊學為基礎的宏基因組挖掘和篩選。透過不斷的除錯，研究者構建出了較為完善的生物資訊學篩選流程，從而在宏基因組中找到了眾多潛在的RCas系統。之後透過成熟的實驗流程，研究者對候選系統中Cas效應蛋白的活性、結構域、crRNA的特點和靶序列特徵進行系統分析，最終發現了多種有應用價值的RCas系統。

就目前而言，RCas系統中以2類系統的II型Cas9和IV型Cas13的應用最為廣泛（圖1b）。傳統的CRISPR-Cas9系統廣泛用於DNA靶向為基礎的基因組編輯等研究。而後透過補充含有PAM序列的寡核苷酸鏈，這類CRISPR-Cas9系統可以實現RNA靶向，最終識別和切割目標ssRNA。與Cas9不同，目前為止發現的Cas13系統只特異性的識別並靶向ssRNA，而且Cas13-crRNA複合物在識別靶序列後，會無差別的切割並降解非目標ssRNA，這一特性後來被廣泛用於分子診斷的研究之中。

除RCas系統之外，研究者對其它型別的RNA靶向技術也進行了簡單的彙總（圖1c），其中包括原核生物的Ago系統，反義寡核苷酸鏈技術（ASOs）以及最近開發的CIRTS技術（詳見BioArt報道：Cell丨CIRTS——RNA編輯新工具），這類技術與RCas系統相比各有優劣之處，同樣值得我們關注。

圖1 RCas系統的篩選和驗證策略（a），RCas系統的種類（b）及其它RNA靶向系統（c）

對RCas系統的篩選過程及種類進行歸納之後，作者從基礎研究和產業界兩個方面對RCas的應用進行了總結。在基礎研究領域，RCas系統可廣泛應用於RNA的檢測和標記（詳見BioArt報道：Mol Cell | 陳玲玲組使用CRISPR-Cas13系統應用於RNA活細胞標記），RNA的表達調控、表觀遺傳修飾（詳見BioArt報道：Nat Chem Biol | 利用CRISPR-Cas9實現位點特異性RNA m6A編輯）、RNA編輯和定位（詳見BioArt報道：Science亮點 | 活細胞中實時觀察基因編輯）及RNA程式設計等領域（圖2）。實際上，在RNA研究領域，還存在多種其它技術，這類技術在多個研究領域有其獨特之處。比如ASOs在RNA表達的調控上同樣出色；而在RNA編輯領域，不依賴於RCas的新型編輯技術也非常有競爭力（詳見BioArt報道：專家點評NBT | 魏文勝組報道新型基因編輯技術）。當然，RCas系統也有其獨特之處，比如Cas9-METTL13/METTL14/ALKBH5/FTO融合蛋白可實現對RNA m6A甲基化修飾的調控（詳見BioArt報道：Nat Chem Biol | 利用CRISPR-Cas9實現位點特異性RNA m6A編輯），RCas系統還能用於RNA結合蛋白的功能研究以及合成生物學中的RNA程式設計。

圖2 RCas系統在基礎生物學研究中的應用情況

除基礎研究外，RCas系統在產業界同樣極具潛力，其中以核酸檢測為基礎的疾病診斷尤為引人注目。Cas13-crRNA複合物在識別靶序列後對其它ssRNA進行無差別切割的能力被研究者廣泛用於包括寨卡、登革熱等多種疾病的診斷（詳見BioArt報道：Nature | 快速、準確、經濟：CRISPR技術在疾病檢測中的崛起）；Cas13的這種特性還可以被改造用於抗病毒藥物的研發，這對病毒感染的治療有重要的意義。研究者還發現，改造RCas系統還可促進有細胞毒性的RNA聚合物的降解，這為包括神經退行性疾病在內的多種疾病的治療提供了新的思路。

最後，研究者還對RCas系統應用過程中需要注意的關鍵點進行了總結：在分子層面這包括如何根據自己的需求選擇不同的RCas系統，是否需要新增額外的效應因子以構建融合蛋白，融合蛋白的構建策略，crRNA靶序列的選擇，RCas系統的遞送策略等等；在細胞層面則需要考慮RCas系統活性的調控，系統安全性及不同組分的比例等。此外，考慮到RCas系統在疾病治療過程中需要持續表達，其面臨的最大挑戰是免疫原性可能引發的免疫反應以及潛在的毒性。

總體而言，雖有多種不足之處，但考慮到RCas研究仍處於起步階段，目前的研究進展依然令人矚目。我們有理由相信，未來以RCas為基礎的工具研發和應用探索會取得更多的成績，這將進一步豐富RNA靶向的工具庫並拓展其應用範圍。此外，相關的研究也會讓我們對RNA靶向研究有更為全面的瞭解和認識。

原文連結

https://doi.org/10.1038/s41556-019-0454-7