神奇的黃綠色熒光色素

1932年的某一天，一位名叫理查德·庫恩（Richard Kuhn）的生物化學家收到了德國《自然科學》（Naturwissenschaften）編輯部的最新一期刊物。要是在平時，庫恩肯定不會對這個德文期刊感興趣。在他的印象中，這本東西無非是英國《自然》期刊的德國山寨版罷了。

圖：理查德·庫恩

不過最近一段時間，庫恩的實驗進展不是很順利，心情也比較低落。抱著放鬆心情的想法，庫恩就隨手翻了翻這本《自然科學》。忽然，他看到了自己的熟人奧托·沃伯格（Otto Warburg）的名字。沃伯格是一名德國的生理學家。庫恩知道他一直在研究微生物發酵過程中的生物氧化作用，但是不知道進行得怎麼樣了。正好借這次機會，庫恩打算讀一讀沃伯格的論文，瞭解一下他最近的實驗狀況。

沃伯格在論文中描述了一種呼吸作用中的氧化酶。這個氧化酶是在啤酒釀造過程中由酵母菌分泌的，呈現黃綠色。如果透過透析的方法，是可以把氧化酶的黃綠色洗掉的，但隨之這個氧化酶的活性也就消失了。庫恩讀到這段話的時候，突然眼前一亮。這個“黃綠色物質”，不正是自己研究了多年的核黃素嘛。

圖：粉末狀核黃素

“這絕對是一次偉大的發現！”意識到這一點的庫恩立刻與沃伯格取得了聯絡，告訴他這一次的發現足以載入史冊。並且有必要立刻召集各路專家，就沃伯格的這次發現開展一次學術會議。

我相信當時的沃伯格和大家的想法都是一樣的。一個小小的氧化酶活性實驗，怎麼就成了一次偉大的發現呢？要理解這件事情的緣由，那得從大約30年前開始說起。

“純淨飲食”引發的思考

20世紀初期，一位美國生物化學家埃爾默·麥科勒姆試圖回答所有營養學家都感興趣的兩個問題：“有多少種營養物質是人類所必須的？它們分別是什麼?”這兩個問題放在今天，那是再簡單不過了。不過在那個年代，維生素都還沒有被發現。探索未知的營養物質，就跟在地球上探索新大陸那樣令人著迷。

圖：埃爾默·麥科勒姆

麥科勒姆從小就對這個世界充滿了好奇心，養成了廣泛閱讀書籍的良好習慣。在唸高中的時候，他愛上了學校的《大英百科全書》，省吃儉用花25美元買了一套。當時的25美元差不多是他兩個月的打工收入。性格內向的麥科勒姆和女孩子說話都會臉紅，但是一旦聊起大英百科全書的內容，他就會變得滔滔不絕。

圖：《大英百科全書》

1907年的某天，麥科勒姆購買了德國生物學家理查德·馬利編寫的三十七卷《人類進化史》，打算花一年的時間仔細閱讀一下。根據書中記載，1873年至1906年間，人類在小動物身上進行了大約13項實驗。在這些實驗中，小動物都未能正常成長，幾個星期之後就死了[1]。在反覆研究之後，麥科勒姆找到了這些實驗中的一個共性：所有的小動物的飼料，僅僅只包含了純化後的蛋白質、脂肪、碳水化合物和無機鹽，沒有任何別的物質[2]。他對此感到十分好奇，他覺得，這些實驗不正是說明了僅僅吃這些純化後的食物是不夠的嗎？

於是，麥科勒姆決定從營養學的角度，對這個問題進行解答。首先，他給上述實驗中的飼養方式起了一個名字，叫做“純淨飲食”。然後，為了尋找“純淨飲食”中缺少什麼必要的營養物質，他打算在老鼠身上做相關實驗。1908年1月，美國首個用於營養學研究的鼠群就誕生了。

圖：常用於實驗研究的小白鼠

在接下來的7年裡，麥科勒姆和他的助手瑪格麗特·戴維斯對“純淨飲食”造成的小鼠發育不良現象進行了詳細的研究[3][4]。他們發現，如果在“純淨飲食”中新增2%的小麥胚乳或者牛奶粉末， 小鼠們的生長就會恢復正常。因此麥科勒姆認為，在小麥胚乳或者牛奶中，有一種“未知物質”對幼鼠的生長是必不可少的。剛開始，麥科勒姆以為這種物質就是克里斯蒂安·艾克曼早些時候描述的“抗腳氣病因子”，因為當時已經知道糙米飲食可以治療腳氣病。但是在後面的實驗中，他還觀察到這種“未知物質”十分耐熱，在100攝氏度下加熱1小時都不會失去活性[5]。這種耐熱的特性似乎與抗腳氣病因子有所不同，不過可惜的是，麥科勒姆最終沒能夠成功提純和分離這種物質。

關於艾克曼的抗腳氣病因子，我們在腳氣病那一期已經有了詳細的介紹，感興趣的朋友可以翻看《維生素那些事兒》的第一期節目。這裡就不再多聊了。

差不多在同一時期，約瑟夫·哥德伯格在美國南部各州負責調查糙皮病的原因。當他看到麥科勒姆的實驗後，立刻對其進行了重複。在他的實驗裡，這些“純淨飲食”的幼鼠也可以透過在食物中新增酵母而獲得健康，但是在恢復之前，它們都會有不同程度的面板損傷。哥德伯格毫不猶豫地認為，麥科勒姆報道的“未知物質”就是自己預言的“抗糙皮病因子”。

不過就這件事上，我們還真的不能責怪哥德伯格。因為他確確實實在實驗中看到了小鼠的面板出現了損傷。1927年，哥德伯格也用他的這個實驗成功說服了當時的英國膳食委員會（British Committee on Accessory Food Factors），認為這個“未知物質”就是“抗糙皮病因子”。

“可重複性”和“可再現性”

然而，有兩位英國營養學家——哈利耶特·奇克（Harriette Chick）和瑪格麗特·羅斯科（Margaret Roscoe）始終對這個結論抱有一絲懷疑[6]。第二年，也就是1928年，為了驗證“未知物質”到底是不是“抗糙皮病因子”，奇克和羅斯科翻閱了至今為止所有的類似研究。在這些研究中，缺乏“未知物質”的小鼠偶爾會有面板炎的症狀出現，但是有時候又不會出現面板炎。這個現象讓兩人覺得“未知物質”其實並不是一個單一物質，很可能是個複合物，至少它的主要成分肯定不是“抗糙皮病因子”。

在科學界，科學家們對每一項科學研究的可重複性都是有嚴格的要求的，不過我覺得“重複性”一詞算得上是翻譯得最糟糕的科研詞語之一。英文的科學論文中，有repeatability和reproducibility之分。前者應該翻譯成可重複性，後者應該翻譯成可再現性。重複性看的是針對同一個實驗，同一儀器或個人在同一條件下測量的結果變化，反應的是實驗的誤差。而再現性看的是整個研究或實驗是否可以被其他人完整複製。如果能夠分清可重複性和可再現性，那麼就不難理解哥德伯格為什麼會出錯了。

圖：Repeatability（重複性）V.S Reproducibility （再現性）

哥德伯格的實驗中觀察到了面板炎，這個現象在他眼中是具有重複性的。但是如果結合所有類似的研究進行綜合薈萃分析，就會發現面板炎現象並不具有再現性。這條線索引起了一位生物化學家——保羅·格爾吉的注意。格爾吉覺得，有必要對“未知物質”做一下深入研究，至少要對許多研究人員難以再現小鼠面板炎症狀，作一番解釋。在仔細閱讀了前人研究之後，他覺得，問題應該出在“純淨飲食”和新增物上。

圖：保羅·格爾吉

首先由於各個實驗室的提純技術有限，有些實驗室使用的“純淨飲食”並不那麼純淨，其次，目前為止所有的新增物都是牛奶、小麥胚乳、酵母等混合物，並沒有對某個物質進行單獨分析。

這些變數沒有得到嚴格的控制，才導致了不同科學家之間的實驗再現性比較低。於是，格爾吉找到了理查德·庫恩（Richard Kuhn），打算對小鼠“純淨飲食”實驗做一個蓋棺定論[7]。庫恩是一名奧地利-德國生物化學家。當時，他在海德堡大學擔任化學系主任。最擅長的科目就是有機化學和有機物質的提純。在庫恩的幫助下，“純淨飲食”的純度到達了前所未有的高度。在這個基礎上，格爾吉又添加了硫胺，以排除腳氣病的干擾。在這種飲食下，所有的幼鼠就跟哥德伯格報道的一樣，都出現了面板炎的症狀，同時體重也很快停止了增長。但在新增酵母、米糠、肝臟的水提取物和濃縮牛奶以後就恢復了健康。

這項研究就已經把範圍縮小到了上述食物中的水溶性物質中。幸運的是，格爾吉和庫恩都在這些水提取物中觀察到了一個現象：它們都含有一種黃綠色熒光色素。這種色素在中性溶液中可以穩定耐熱，但是用可見光照射6小時以上之後，就會被破壞[8]。

利用這一特性，格爾吉和庫恩利用酵母提取物又做了一次小鼠實驗。所有的處理都和以前一樣，只不過這一次，他們把酵母提取物進行了充分的光照。也就是說，在這次實驗中，他們刻意地破壞了酵母提取物中的黃綠色素。

實驗結果出來以後，格爾吉恍然大悟。所有的幼鼠都沒有表現出面板炎的症狀，可是它們也沒有生長。這些結果足以證明幼鼠的生長停滯和面板炎是由不同的因子造成的，麥科勒姆發現的“未知物質”更有可能是這種“黃綠色熒光色素”，並非哥德伯格所說的“抗糙皮病因子”。自那以後，格爾吉就給這種色素起了一個新名字，叫“促生長因子”。

格爾吉成功地驗證了“未知物質”的功能，並將其與“抗糙皮病因子”劃清了界限。然而庫恩卻並不滿足於此，學有機化學出身的他，更想搞清楚這種“促生長因子”的結構。想要更深刻地理解它的作用。

寫在最後

和糙皮病，腳氣病不同的是，當時的人類社會並沒有任何嚴重的致命疾病是和缺乏這種黃綠色的“促生長因子”有關的。因而，“促生長因子”在當時的科研界並不受到重視，甚至有人質疑它的研究價值。這些問題，正是庫恩即將面對的。克服種種阻礙，堅持研究“促生長因子”的庫恩最後給人類帶來了怎樣的突破呢？我們在下一期節目中揭曉答案，記得關注喲！

關於作者參考文獻

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Elmer_McCollum

[2] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5335920/

[3] https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925818876128

[4] https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925818876116

[5] https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002192581887613X?via%3Dihub

[6] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1252189/

[7] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16745720/

[8] https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1753-4887.1954.tb03214.x