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基因轉錄是所有原核和真核生物最基礎的生命活動之一，是中心法則的重要一環。真核生物轉錄與原核生物轉錄最大的區別在於：負責啟用基因轉錄的轉錄啟用子（transcriptional activator）在原核生物中直接與核心轉錄機器RNA聚合酶結合；而在真核生物中，轉錄啟用子不直接與RNA聚合酶II（Pol II）結合，而是由一個被稱為中介體（Mediator）的超級複合物介導。換句話說：在真核生物中，中介體複合物在轉錄啟用子和Pol II之間起到一個橋樑的作用。中介體複合物對幾乎所有真核生物基因的轉錄都是必需的。

中介體複合物是在Roger D. Kornberg教授（2006年諾貝爾化學獎得主）的實驗室中被發現的（Kelleher et al., Cell, 1990; Flanagan et al., Nature, 1991）。Richard A. Young等人的實驗室證明了中介體複合物含有許多在調控分子的遺傳篩選中鑑定出的成分（Thompson et al.,Cell, 1993）。1999年，Kornberg實驗室在Science發表論文，用負染電鏡的方法觀察到了釀酒酵母和小鼠中介體複合物的大致形狀，證明了該複合物的普遍性（Asturias et al., Science, 1999）。自從Kornberg實驗室純化得到中介體複合物後，世界上多個實驗室對它的結構生物學研究開展了持續攻關。釀酒酵母中介體複合物包含21個亞基，並且被劃分為頭部、中部和尾部三個模組。由於成分複雜多變、柔性極強，解析完整中介體複合物高解析度結構一直是領域內的難題。2011年和2012年，中介體頭部模組4.3 Å和3.4 Å的晶體結構先後在Nature上發表（Imasaki et al., Nature, 2011; Lariviere et al., Nature, 2012）；2017年，中介體複合物頭部與中部模組複合物4.4 Å的冷凍電鏡結構和3.4 Å的晶體結構先後發表於Nature（Tsai et al.,Nature, 2017; Nozawa et al., Nature, 2017）。儘管已有多箇中介體亞複合物的高解析度結構被解析和報道，但是負責與轉錄啟用子直接結合的尾部模組（400 kDa）以及完整中介體複合物始終沒有高解析度結構。由於完整複合物高解析度結構的缺失，人們對於中介體複合物如何參與轉錄調控的理解也非常有限。

2021年2月10日，Roger D. Kornberg領導的上海科技大學免疫化學研究所-斯坦福大學聯合研究團隊在Molecular Cell以研究長文（Article）的形式，線上發表了題為 Mediator structure and conformation change（中介體複合物的結構和構象變化）的研究論文，首次報道了完整中介體複合物（Mediator）的近原子解析度冷凍電鏡結構，及其在結合RNA聚合酶II（Pol II）前後發生的構象變化，為進一步理解中介體複合物參與轉錄調控的分子機制提供了重要基礎，是轉錄調控這一基礎研究領域的重要進展。

由於酵母和哺乳動物來源的中介體複合物柔性非常強、結構均一性差，解析該複合物的高解析度結構難度較大。結構生物化學實驗室助理研究員張賀橋博士另闢蹊徑，選擇研究來源於嗜熱毛殼菌（一種耐熱真核生物）的中介體複合物（嗜熱毛殼菌來源的蛋白由於熱穩定性較高，更適合開展高解析度結構生物學研究），透過對嗜熱毛殼菌進行基因組改造，在Med6羧基端融合了可以用於親和純化的標籤。透過發酵罐培養，最後從溼重約兩公斤的細胞中純化得到了單獨中介體及中介體與Pol II複合物的高質量蛋白樣品，並與諶東華博士（斯坦福大學醫學院結構生物學系Kornberg組高階科學家）合作，利用冷凍電鏡解析了完整中介體（6.6 Å）及其與Pol II的複合物結構（4.3 Å）。在中介體與Pol II的複合物結構中，頭部模組與中部模組解析度為4.2 Å，而之前沒有任何高解析度結構資訊的尾部模組解析度達到了3.6 Å。基於該結構，聯合研究團隊首次在中介體上鑑定到了轉錄啟用子可能的結合位點。此外，透過比較完整中介體及其與Pol II的複合物結構，發現了中介體在結合Pol II前後發生的構象變化：結合Pol II後，尾部模組發生轉動，Med1蛋白髮生輕微平移，Pol II-CTD（C-terminal domain，羧基端結構域）結合位點處的缺口發生關閉。這些構象變化為理解中介體參與轉錄調控的分子機制提供了重要啟示。

完整中介體複合物的近原子解析度冷凍電鏡結構，及其在結合Pol II前後發生的構象變化。

據悉，免疫化學研究所結構生物化學實驗室助理研究員張賀橋為第一作者，Kornberg教授為首要通訊作者（lead contact），Co-PI聶焱為共同通訊作者，上海科技大學為第一完成單位。其他作者包括斯坦福大學的諶東華博士、結構生物化學實驗室高階工程師王雁南、博士後王春年、博士生原超、王琳、以及斯坦福大學的其他合作人員；上海科技大學生命科學電鏡平臺也給予了大力支援和幫助。

該文的通訊作者之一聶焱說到：“自1990年首先在酵母中發現中介體複合物以來，Roger D. Kornberg教授斯坦福大學課題組已在該領域深耕超過30年，並發表了20餘篇重要論文。值得一提的是，雖然Kornberg教授的諾獎報告（2006年12月）主要介紹了Pol II的結構及功能，但最後兩頁都用於展示中介體複合物的科研進展（中介體-Pol II複合物的低解析度電鏡結構、以及頭部模組的晶體照片和相關資料），充分體現出Kornberg教授對於中介體複合物的重視。除Kornberg教授外，幾位在他實驗室學習和工作過的學者們也在中介體複合物領域，尤其是結構生物學研究方面取得了許多重要進展（如德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的Patrick Cramer教授、美國科羅拉多大學醫學院的Francisco Asturias教授等）。所以，Kornberg教授可以說是中介體複合物領域的‘奠基人’。

我們實驗室從建立之初（2012年年底）就聚焦於中介體複合物的結構與功能研究。我在2015年11月加入後，引進了能高效重組表達多蛋白複合物的MultiBac桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統，該系統很快幫助我們成功製備了一系列來源於嗜熱毛殼菌的中介體中部模組亞複合物。在對這些亞複合物進行負染電鏡初步觀察和分析後，我們發現它們和相應的釀酒酵母中介體亞複合物在整體結構上高度相似（儘管相應亞基的氨基酸序列一致性僅為20%左右），這提示嗜熱毛殼菌的中介體複合物和釀酒酵母及其他物種的中介體複合物在結構上應是高度保守的。然而，在2017年3月和5月，Francisco Asturias課題組和Patrick Cramer課題組先後在Nature上發表了兩篇關於中介體複合物的結構生物學文章，報導了裂殖酵母中介體複合物的頭部模組、中部模組以及Med14亞基的高解析度結構（分別為4.4 Å的冷凍電鏡結構和3.4 Å的晶體結構），但尾部模組及Med1亞基仍然缺乏高解析度結構資訊。因此，我們實驗室的研究重心開始聚焦到完整中介體複合物及其尾部模組上來。

我們實驗室的助理研究員張賀橋博士（博士畢業於清華大學柴繼傑課題組，2017年1月加入本實驗室）接手了內源純化嗜熱毛殼菌中介體複合物這一技術難度極高的任務。在Kornberg斯坦福實驗室其他成員前期工作的基礎上，透過艱苦不懈的努力，逐步攻克了嗜熱毛殼菌的基因改造、小量培養以及大規模發酵培養等技術難點，最終成功純化得到了毫克級別的高純度蛋白樣品（單獨中介體及中介體-Pol II複合物），為後續與諶東華博士（斯坦福大學醫學院結構生物學系Kornberg組高階科學家）合作解析其高分辨冷凍電鏡結構並研究構象變化打下了堅實的基礎；諶東華博士在冷凍電鏡資料收集和處理上的豐富經驗也為本課題的順利進展做出了重要貢獻。

以上簡要回顧了實驗室這些年來在中介體複合物研究上走過的歷程，我深切地感受到我們之所以能做出一些成績，是因為站在了“巨人的肩膀上”——今天上線的這篇論文離不開學校和研究所對我們實驗室的長期支援、Kornberg教授多年來一以貫之的悉心指導、以及以張賀橋博士和諶東華博士為代表的聯合課題組成員及合作者們長期以來的不懈努力。我們實驗室也將努力在這一領域做出更多有意思的發現，與國內外同行一起不斷深化我們對於中介體複合物這一關鍵轉錄輔因子在基因轉錄、表觀遺傳、染色質高階結構、相分離、乃至於疾病發生髮展等領域的認識。”

文章作者合影（從左到右：王琳、王春年、張賀橋、Roger D. Kornberg、聶焱、原超、王雁南）

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.01.022

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