RNA-seq能夠全面快速地獲取特定樣品的所有轉錄本的資訊，並且具有基因表達水平檢測範圍廣，技術背景噪音低的優點，目前已經成為了轉錄組分析的首選方案。常規的RNA-seq文庫構建方法較為繁瑣，通常包括mRNA的分離，mRNA片段化，反轉錄合成cDNA第一鏈，cDNA第二鏈合成，雙鏈cDNA末端修復和加腺苷酸A，接頭的連線，PCR富集等步驟。另外，利用常規的RNA-seq方法構建不同樣品的測序文庫時，每一個樣品都需要獨立處理。因此，針對大量樣本時常規的RNA-seq方法不僅成本較高，而且費時費力。而實際中，很多的研究都需要對大量樣本的轉錄組進行測序分析，包括繪製不同組織樣本的轉錄組圖譜，同一組織樣本的轉錄組動態分析，以及群體中基因表達水平變異和調控分析等。

近日，中國農業大學農學院賴錦盛課題組在JIPB線上發表了題為“MP3RNA-seq: massively parallel 3ʹ end RNA sequencing for high-throughput gene expression profiling and genotyping”的研究論文。該研究建立了一種針對大量樣本的轉錄組文庫構建和測序方法。該方法文庫構建和測序的總費用約為45 RMB/樣品，只有常規RNA-seq方法成本的1/10，適合於高通量的基因表達分析和基因型分析。

賴錦盛課題組透過在反轉錄合成cDNA第一鏈的過程引入一級條形碼，實現了不同待測樣品文庫在同一實驗中的並行構建。透過在反轉錄合成cDNA第一鏈的過程引物唯一分子識別碼，實現了PCR過程產生的重複序列的有效識別和去除。透過引入一級和二級條形碼，以及透過基於轉錄本3’端對基因表達水平進行檢測，實現了文庫構建和測序的高通量。基於對玉米、擬南芥、人和小鼠等樣品的分析表明該方法具有與常規RNA-seq方法相當的基因表達水平檢測準確性和表達基因檢出效率。此外，利用MP3RNA-seq方法成功的對一個包含477個DH系的玉米群體進行了基因表達水平和基因型分析，並以此為基礎對基因表達調控位點和株高、穗位高和相對穗位高的調控位點進行QTL定位。研究鑑定到了25797個eQTL，其調控15335個基因。此外鑑定到了21個株高、穗位高和相對穗位高的QTL，包括一個落在2號染色體20-30 Mb的QTL，其同時影響這三個農藝性狀。

MP3RNA-seq文庫構建流程示意圖

中國農業大學農學院博士後陳建和博士生張湘博為該論文的第一作者，賴錦盛教授和博士後陳建為通訊作者。

論文連結：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/jipb.13077