基因編輯的利刃——CRISPR技術這些年都經歷了什麼

最近，以CRISPR為代表的基因編輯技術，又一次被推上風口浪尖。

其實，就在不久前，CRISPR技術的專利歸屬問題才剛剛塵埃落定——美國聯邦法院判定麻省理工學院和哈佛大學獲得CRISPR專利，結束了關於這場長達5年的爭論。

作為目前最有效的基因編輯技術，CRISPR技術到底經歷了哪些發展與爭議，它所代表的基因編輯技術又將走向何方呢？

CRISPR的誕生

事情要從1987年說起。這一年，日本科學家第一次在大腸桿菌的基因組中發現了重複性迴文序列，然而，當時並未引起諸位學者的注意。

兩年以後，西班牙阿利坎特大學的博士研究生Francisco Mojica在做自己的博士課題時，在一種名為H.volcanii 的古細菌中也發現了重複性迴文序列。他查了文獻，發現兩年前的日本科學家也發現了類似的迴文結構，透過比較發現，兩者並未有任何同源序列。

雖然不知道這些迴文結構有什麼功能，但他覺得非常有意思，並將其命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats[1]，簡稱CRISPR，翻譯過來大致是“簇狀規律型間隔迴文序列”。1992年，他發表了一篇文章，描述了這個迴文結構，並順拿到博士學位，到牛津大學做了兩年的博士後。博士後出站以後，他回聘到阿利坎特大學，重拾了他博士時期發現的CRISPR的研究工作。

鑽研了十餘年，到2003年，他終於弄明白這個迴文結構的生物學功能——古細菌的適應性免疫[3]。為此，他和他的課題團隊成員開了一個盛大的party慶祝，並且覺得這個工作一定能發表在《科學》、《自然》等世界頂級期刊上。派對結束後的第二天，Mojica就開始撰寫論文，投稿到這些頂級雜誌。

這些期刊的編輯們雖然對這一工作表示了足夠的興趣，但是指出Mojica的工作並沒有闡釋機理，而只是在做假設，就拒稿了。在長達兩年的反覆拒稿以後，文章最終發表在了《分子進化》（Molecular Evolution）上。

與此同時，法國學者Bolotin在研究釀膿鏈球菌Streptococcus thermophilus時發現了與Mojica研究組相似的CRISPR序列，以及一個新的基因，用來編碼一個具有核酸酶功能的蛋白，也就是後來的Cas9，並預測CRISPR的功能大約是與適應性免疫相關[4]。

這篇文章提交的時間大約比Mojica文章被接受的時間早兩個月。

在接下來的四五年間，世界各地的科學家們似乎忽然有了指路明燈一般，很快搞清楚了CRISPR序列的功能，以及細菌適應性免疫的工作機制——Cas蛋白具有核酸酶的功能，能夠剪下DNA，而CRISPR能夠轉錄成RNA引導Cas蛋白對基因組中特定的DNA序列進行剪下。

釀膿鏈球菌（Streptococcus thermophilus）中的CRISPR-Cas9系統。圖

正是這兩個研究組，在接下來幾年，為了誰最先發明CRISPR技術，展開了激烈的爭論。雖然，從論文發表時間上說，確實是Doudna領先一步，但是，張鋒2014年就已經申請到了CRISPR技術的發明專利。

科學之爭or利益之爭？

雖然外行人會抱有“看熱鬧，不嫌事兒大”的心態，但是對科學家們來說，誰做了什麼工作，做了多少工作，都心裡有數。

那麼爭議來自哪裡呢？是科學家自身嗎？

我們先來看一些事件——

一週後，學院的一位資深教授特地找她談話：你不要這樣搞事情，張鋒並不是壞人，他也沒有做任何壞事。

其實，早在2014年，張鋒獲得CRISPR技術專利許可以後，就將這項技術以及實驗室所有的相關實驗材料資訊公之於眾，免費供全世界學者和機構科研之用。

2017年底，張鋒當選為美國科學院院士，也可以反映出科學界對張鋒的貢獻是非常認可的。

所以，從這些層面上來說，CRISPR技術專利之爭，並不是科學之爭。爭論的主角也並非這三個研究機構，而是與這三個機構所有關的諸多大型生化公司。

因為技術的應用，離不開產業化，MIT和UCB為代表的研究機構只負責科學研究，成果轉化必須依靠對應的大公司。所以，所謂的專利之爭，其實是各個公司的產品和市場之爭。

CRISPR技術—— 一把“未打磨好的利刃”？

美國聯邦法院的判決，算是暫時平息了這場紛爭。可是人們不禁要問了，CRISPR技術到底有哪些用處？為何導致三家機構不惜耗巨資打官司呢？

原因說起來也很簡單——這項技術是目前為止最為有效的基因編輯技術。已經普遍應用到醫療、農業等諸多方面。

雖說它是目前最行之有效的技術，但並不能代表著百分之百的可靠。

作為一把基因編輯的利刃，CRISPR目前存在一個重要的缺陷——脫靶。簡單的說就是，這把刀雖然很鋒利，但是，經常砍錯地方。

一項關於人類胚胎細胞的修飾研究工作中，CRISPR技術的成功率僅為14.3%——這麼低的精度在醫學上是不可能被接受的。從這點上說，現行的CRISPR技術僅僅是一把未打磨好的利刃。

CRISPR技術將走向何方

基因編輯技術無疑將成為未來一項非常重要的技術。目前為止，CRISPR技術主要應用在農業和醫學方面，並取得一些成果。比如農業方面，這項技術主要用來改造植物基因組，用以製造耐旱或者抗病的株系。如今已經成功應用到大豆，玉米，菸草，番茄，小麥等農作物上，很多成果轉化也會在未來逐一呈現[5]。

臨床上，這項技術被用於一些遺傳疾病的篩選、預防和治療。一些治療方案在動物疾病模型中已經取得很好的效果。此外，還能改造人體免疫細胞——T細胞，讓它們能夠特異的靶向癌細胞，達到癌症治療的目的。

CRISPR的研究還不止於此，一項最新的研究利用CRISPR技術創造出可程式設計的核酸成像技術，能夠跳過了轉錄、翻譯兩個步驟，直接觀察到蛋白的表達。另外一項研究中，研究人員將綠色熒光蛋白融合在dCas核酸酶上，並在末尾加了一段特殊最佳化的RNA序列，實時觀察到端粒上的動態結構以及細胞內的基因編碼過程[6,7]。

CRISPR-Cas核酸成像技術：正進行有絲分裂的海拉細胞中的一個基因的亞細胞定位。

此外，目前研究最多的是Cas9。而Cas蛋白家族還有一大家子成員，如Cas12a, Cas13, Cas10等[8,9]。很多成員的功能很奇特，比如Cas13具有RNA酶的功能可以對RNA進行識別和編輯。現在人們已經可以利用Cas13發展RNA成像技術以及快速檢測薩卡病毒的單鏈RNA。這無疑對於疾病的預防極為重要。

總之，雖然CRISPR-Cas技術目前仍存在許多問題，但並不能掩蓋其巨大的應用價值。這項技術已經為人類的社會科技的發展打開了一扇窗，“寶劍鋒自磨礪出”，我們期待CRISPR這把利刃，能在眾多科研人員的努力下，被不斷打磨和完善，使之為人類創造更多的價值。

不過至少在現階段，它還不能成為解鎖人類基因技能的“萬能鑰匙”，一切操作仍需謹慎——雖然技術本無正邪之分，但使用技術的人，將決定它最終的走向。

作者名片

參考文獻：

1. Knott, G. J. & Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science 361, 866 (2018).

2. Lander, Eric S. The Heroes of CRISPR. Cell 164, 18-28, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.12.041 (2016).

3 . Shan, Q. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology 31, 686, doi:10.1038/nbt.2650

https://www.nature.com/articles/nbt.2650#supplementary-information (2013).

4 .Chen, B. et al. Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. Cell 155, 1479-1491, doi:10.1016/j.cell.2013.12.001 (2013).

5.Knight, S. C., Tjian, R. & Doudna, J. A. Genomes in Focus: Development and Applications of CRISPR-Cas9 Imaging Technologies. Angewandte Chemie International Edition 57, 4329-4337, doi:doi:10.1002/anie.201709201 (2018).

6.Gootenberg, J. S.

et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science 360, 439 (2018).

9.Myhrvold, C. et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science 360, 444 (2ployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science 360, 444 (2018)