冷凍電鏡全稱冷凍電子顯微鏡（Cryoelectron Microscopy），簡單理解為用電子顯微鏡去觀察冷凍固定的樣本，得出清晰三維結構。可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。

左邊是2013年前人們能得到的分子影象，右邊是冷凍電鏡技術的結果

1. 什麼是冷凍電子顯微鏡技術

冷凍電子顯微鏡技術，也叫冷凍電鏡技術，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，即把樣品凍起來並保持低溫放進顯微鏡裡面，用高度相干的電子作為光源從上面照下來，透過樣品和附近的冰層，受到散射。我們再利用探測器和透鏡系統把散射訊號成像記錄下來，最後進行訊號處理，得到樣品的結構。冷凍電鏡技術作為一種重要的結構生物學研究方法，它與X射線晶體學、核磁共振一起構成了高解析度結構生物學研究的基礎。這項技術獲得了2017年的諾貝爾化學獎。獲獎理由是“開發出冷凍電子顯微鏡技術(也稱為低溫電子顯微鏡技術)用於確定溶液中的生物分子的高解析度結構”，簡化了生物細胞的成像過程，提高了成像品質。

2. 冷凍電子顯微鏡成像原理

在光學顯微鏡下，可見光穿過標本就會通過光學透鏡進行折射形成影象。電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是電子顯微鏡採用電子束作光源，採用80-300kV電子束加速電壓，用電磁場作透鏡。兩者的主要區別是解析度不同，而影響解析度的直接因素是光源的波長，即波長越短，解析度越高。光子的波長大概在500nm左右。電子的波長是光子波長的十萬分之一左右。1975年，Henderson通過電子顯微鏡首次解析得到了解析度為0.7nm的細菌視紫紅質的結構，這些開拓性的研究最終確定了細菌視紫紅質以及其他膜蛋白，如水通道蛋白的近原子解析度圖。這些研究為許多二十面體病毒的原子解析度模型的生成奠定了基礎。非有機樣品的解析度甚至更高，它們在成像過程中承受的電子劑量比生物材料高得多，而且結構完整。

那麼，為什麼不能在原子解析度的電子顯微鏡下，直接對單個蛋白質、病毒和細胞的自然狀態進行常規成像呢?

在傳統的透射電鏡下，一般採用使用負染色法來減輕損傷，即在可接觸的分子表面塗上含有重原子的試劑，如醋酸鈾醯，這種試劑的輻射敏感性比有機物低得多。通常形成的細胞、病毒和蛋白質影象解析度在2-4 nm。對未染色標本進行高解析度成像的困難在於，為了使損傷最小化所降低的電子劑量，會產生噪聲影象，而電子劑量高到足以獲得良好的信噪比時，則會導致標本損傷達到不可接受的程度。

為了解決上述為題，冷凍電鏡技術採用了以下兩種方法，第一種方法是使用儲存在液氮或液氦溫度下的冷凍標本進行成像。近40年來，對室溫下衍射強度與低溫下衍射強度衰減的測量表明，低溫電子顯微鏡可以降低輻射損傷的影響。採用一種在一層玻璃態冰中快速冷凍(玻璃化)生物標本，然後在液氮或氦氣溫度下成像的方法，使得低溫電鏡技術得到廣泛應用。將水溶液注入液氮冷卻的乙烷等冷凍液中，是一種用於製備用於層析成像、單顆粒成像以及螺旋和二維晶體的冷凍電子顯微鏡樣品的方法。與室溫下相比，在液氮溫度下成像可以減少多達六倍的輻射損傷。這意味著每單位電子劑量的輻射損傷減少，對於低溫下記錄的影象，可以使用更高的電子劑量來增加信噪比。事實上，液氮和液氦都被成功地用於近原子解析度的三維重建，在它們的冷卻下，解析度可達大約0.4到2 nm。第二種提高信噪比的方法是對大量同一生物標本單元的影象進行平均。該技術首次應用於螺旋組裝體和二維蛋白晶體的室溫成像及低溫成像。這兩個概念，即低溫成像的概念和多幅低劑量影象平均的概念，構成了現代高解析度生物電子顯微鏡的基礎。

3. 冷凍電子斷層掃描技術

電子斷層成像通過獲取同一區域多個角度的投影圖來反向重構所研究物件的三維結構，適合於在奈米級尺度上研究不具有結構均一性的蛋白、病毒、細胞器以及它們之間組成的複合體的三維結構。雖然目前電子斷層成像所獲得的結構的解析度(約4～10 nm)，但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結構和功能中有著不可替代的重要作用。冷凍電子斷層成像的適用尺度非常廣泛， 包括從分子水平的蛋白質， 到亞細胞水平的細胞器， 以至細胞水平的組織結構。它有效地填補了X- 射線晶體學、核磁共振以及冷凍電鏡單顆粒分析等方法得到的高精度結構和光學顯微鏡技術得到的低解析度的細胞整體影象之間的空白。

4. 冷凍電鏡單顆粒技術

冷凍電鏡單顆粒技術利用大量二維投影影象的資料，結合蛋白複合物在不同方向上的相同副本，對結構進行三維重建。和大多數其他低溫電子顯微鏡應用一樣，單粒子成像的第一步是將可溶複合物擴散到碳膜的孔上。然後標本被柱塞冷凍，形成一層薄薄的玻璃態冰，理想情況下，這層冰中含有不同方向的複合物的相同副本。冰層的厚度可能從幾百埃到幾千埃不等，受粒子的尺寸和緩衝區的組成的影響。從含有許多分子複合物的場的影象開始，通過人工或自動演算法選擇單個粒子。一旦選擇統計方法，如主成分分析、多變數分析或協方差分析，可用於根據影象結構特徵的變化對其進行排序。從分子複合體的二維電子顯微鏡投影檢視生成三維重建依賴於所有粒子的相對方向。所涉及的步驟在數學上是複雜的，並利用了中心投影定理，該定理指出，對於一個三維物件，每個二維投影的傅立葉變換是通過該物件的三維傅立葉變換得到的一箇中心切片(圖5)。因此,通過獲得數量足夠大包含相對於電子束各種各樣的方向的分子影象,可以建立3D影象(如圖6所示,顯示2D影象不同取向的GroEL用於獲得其三維結構)。

5. 冷凍電子顯微鏡技術的突破

在最近幾年，冷凍電鏡技術的突破主要體現在三個方面。首先是樣品製備，通過利用薄膜碳層甚至石墨烯可以用更薄的冰層包裹分子樣品來提高信噪比。第二個突破是電子的探測技術，也就是電子探測器的發明。在300 keV 電子的轟擊下，傳統的器件都會被高能量打壞，因此在電子探測器出現之前，冷凍電鏡中使用的CCD相機需要將電子打在探測器上變成光訊號，再通過CCD 把光訊號轉成電訊號後得到影象，“電光—光電”轉換的過程降低了信噪比。而現在電子探測器能夠直接探測電子數量，同時，互補型金氧半導體(CMOS)感光元件的應用使得探測器支援電影模式(movie mode)，可以在一秒鐘之內獲得幾十張投影圖片。通過後期對樣品進行漂移修正，再把這幾十張圖片疊加起來，從而大幅提高成像的信噪比。模糊的影象一下子變得清晰，冷凍電鏡的解析度不斷上升。第三個突破是計算能力的提高和軟體演算法的進步。冷凍電鏡的模型重構通常需要對幾萬甚至幾十萬張投影圖片進行分析、組裝和優化。這需要先進的計算資源配合有效的演算法才能實現。綜上所述，冷凍電鏡技術不僅提高了空間解析度，而且可以應用於很多以前不能解決的生物大分子的結構研究。[2]

參考文獻：

[1] Jacqueline L. S. Milne, Mario J. Borgnia, Alberto Bartesaghi, et al. Cryo-electron microscopy – a primer for the non-microscopist.doi:10.1111/febs.12078

[3] Hong-Wei Wang,Jianlin Lei, and Yigong Shi.

Biological cryo-electron microscopy in China.DOI: 10.1002/pro.3018