責編 | 兮

抗生素耐藥已經成為全球範圍內廣泛存在的重要問題，開發新的抗生素來解決這一問題具有重要意義。一直以來，放線菌產生大量臨床使用的抗生素及其他次級代謝產物，在醫藥和農業領域均有重要應用。放線菌中次級代謝產物生物合成基因簇的表達，經常受到擴散性細菌激素的調控。迄今為止，在放線菌中共發現了4類不同結構的細菌激素可調控抗生素的生成，包括γ-丁內酯類（GBLs），2-烷基-4-羥甲基呋喃-3-羧酸類（AHFCAs），4-烷基丁烯酸內酯類（ABs）和2-烷基-4-羥基-3-甲基丁烯酸內酯類（AHMBs）(下圖)。這些小分子細菌激素常透過與TetR家族轉錄抑制因子（TFTR）結合來調控代謝產物的產生，如γ-丁內酯類小分子A-factor在灰色鏈黴菌中透過與轉錄抑制因子ArpA作用，調控氣生菌絲的形成和鏈黴素的產生。

近日，來自英國華威大學和澳大利亞莫納什大學的Greg Challis團隊和Christophe Corre團隊（共同一作為周珊珊、Hussain Bhukya和Nicolas Malet）合作在Nature雜誌線上發表了研究論文“Molecular basis for control of antibiotic production by a bacterial hormone”，該研究闡述了放線菌中一類細菌激素AHFCAs與轉錄抑制因子相互作用，進而調控抗生素生物合成的分子機制。

放線菌模式菌株天藍色鏈黴菌Streptomyces coelicolor A3（2）生成一組呋喃類細菌激素AHFCAs，誘導次甲黴素（methylenomycin）的生成。在該抗生素生物合成基因簇的一端，存在含有3個基因的操縱元負責AHFCA的生物合成。該操縱元上游的mmfR基因編碼一個ArpA樣的轉錄抑制因子MmfR，研究人員推測該蛋白可與次甲黴素生物合成基因簇中特定啟動子區域結合以抑制啟動子下游DNA的轉錄，AHFCA與之結合使其從啟動子區域釋放，從而啟動該基因簇中轉錄啟用因子mmyB的表達，進而啟用次甲黴素的生物合成。儘管放線菌中TetR家族轉錄抑制因子調控抗生素耐藥基因表達的過程已經比較清晰，但關於調控抗生素生物合成的ArpA樣TFTR如何識別激素分子進而釋放DNA的分子機制，目前仍所知甚少。在該項研究中，研究人員透過對次甲黴素基因簇的生物資訊學分析，在其基因簇中兩個操縱元附近鑑定出兩個長度為18個鹼基對並高度同源的偽迴文序列，凝膠遷移實驗和熒光各向異性測量均顯示MmfR可與該預期的兩個操縱子（operator）附近的DNA片段結合。DNA序列的微小差異可能導致它們對MmfR的親和度也存在差異。天藍色鏈黴菌產生的5種AHFCA分子不僅在體外實驗中均可使MmfR與結合的DNA片段解離，在菌株抗生素誘導實驗中同樣可誘導次甲黴素的生成，同時AHFCA分子烷基側鏈的結構差異導致他們的活性強弱略有不同。已知天藍色鏈黴菌也會生成γ-丁內酯類激素分子如SCB1，其可調控另一生物合成基因簇（coelimycin）的表達。研究人員採用合成的SCB1和凝膠遷移實驗，發現SCB1無法解離MmfR與DNA的結合，從而揭示了GBL和AHFCA兩類細菌激素調控通路的獨立性。應用X射線晶體衍射技術，該研究獲得了轉錄抑制因子MmfR及其與AHFCA小分子結合的蛋白複合物的三維結構（解析度1.5Å）。其中N端前三個α螺旋形成DNA結合結構域（DBD），α螺旋4-9構成了激素結合結構域（HBD），α螺旋8和9形成同源二聚化介面。6個氨基酸殘基形成容納激素分子烷基側鏈的疏水口袋，另外若干關鍵氨基酸殘基與激素分子的羧基和羥甲基極性部分形成氫鍵作用。由於MmfR與DNA操縱子（operator）片段複合物的結晶很難獲得，該研究應用單顆粒冷凍電鏡技術得到了MmfR-DNA複合物的三維結構（解析度4.2 Å）。其中，兩個MmfR同二聚體結合到DNA雙鏈的相對面上。結合MmfR-AHFCA複合物的晶體結構，研究人員發現同二聚體內DBD之間的距離從蛋白-激素複合物中的47.6Å減小到了蛋白-DNA複合物中的37.6Å。這種構象變化，顯示蛋白在與激素分子結合後導致的DNA結合結構域向激素結合結構域方向上移，阻止了MmfR與DNA雙鏈大溝的結合（下圖）。

接著研究人員透過與放線菌中其他已知激素分子類別的ArpA樣轉錄抑制因子的序列比對，發現在所有ArpA樣轉錄抑制因子中，除口袋底部的氨基酸殘基外，形成烷基鏈結合口袋的大部分殘基高度保守。多個殘基特別是Q130和Y85在結合AHFCA類激素的轉錄抑制因子中均保守存在。MmfR與AHFCA激素分子之間以及MmfR蛋白結構內部透過各種氫鍵、疏水作用和極性作用，引發從激素結合結構域到DNA結合結構域的訊號轉導，從而促使α螺旋6的C-末端下移和α螺旋4的N-末端內移，進而拉動α螺旋1的N-末端朝向激素結合結構域移動，重新定位DNA結合結構域。其他ArpA樣轉錄抑制因子可能採取類似的訊號轉導機制。研究人員採用定點突變生成了MmfR的Y85F和Q130E突變體，凝膠遷移實驗和熒光各向異性測量均顯示這些殘基在蛋白與激素的相互作用中具有關鍵作用。此外，研究者還設計合成了一系列天然AHFCA激素分子的類似物，探討了分子中不同官能團對與MmfR相互作用的影響，總結其構效關係。總的來說，該項研究透過對次甲黴素中轉錄抑制因子與對應細菌激素及DNA操縱子的相互作用的探索，闡明瞭在細菌激素存在下ArpA樣轉錄抑制因子識別配體併發生訊號轉導從而釋放DNA調控抗生素表達的分子機制。這些發現將有助於開發細菌激素及其相關的轉錄抑制因子在合成生物學和新抗生素髮現中的應用。在過去的二十年中，僅有少數幾個四聚體TFTR-DNA結構被報道，顯示出X射線晶體學分析在這些系統中所面臨的挑戰。相信冷凍電鏡的使用將促進對類似複合物的結構表徵，從而有助於從分子水平理解其他轉錄因子的調控機制。

原文連結https://www.nature.com/articles/s41586-021-03195-x

製版人：琪醬